本发明专利技术涉及一种基于核酸适体荧光探针的促红细胞生成素EPO试剂盒，同时本发明专利技术还涉及测定促红细胞生成素EPO浓度的方法、测定试剂组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂盒主要成分包括：红细胞裂解液、磷酸缓冲液PBS、促红细胞生成素EPO标准品、促红细胞生成素EPO核酸适体荧光探针；通过血样裂解、混合卵育处理，结合荧光分光光度计检测，从而测算出促红细胞生成素EPO的浓度大小。本发明专利技术具有样品处理简单，操作简便，检测时间短，检测特异性强，灵敏度高，检测结果重复性高等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学检验测定
，特别是涉及基于核酸适体荧光探针EPO3的促红细胞生成素试剂盒及其检测方法。
技术介绍
EPO是促红细胞生成素（ErythropoietEP）的英文简称。人体中的促红细胞生成素是由肾脏和肝脏分泌的一种激素样物质，能够促进红细胞生成。服用红细胞生成素可以使患肾病贫血的病人增加血流比溶度（即增加血液中红细胞百分比）。这种药物近年进入商业市场。人体缺氧时，此种激素生成增加，并导致红细胞增生。EPO兴奋剂正是根据促红细胞生成素的原理人工合成，它能促进肌肉中氧气生成，从而使肌肉更有劲、工作时间更长。促红细胞生成素是对红细胞的生成有增强作用的体液性因子。为分子量6-7万的糖蛋白，糖的含量多，已证明血和尿中都有它的存在。未分化的干细胞分化成红细胞系干细胞（erythropoietinresponsivecell），促红细胞生成素在此发挥作用，使之变为前成红细胞。对进一步再成熟为成红血细胞、网织红细胞，血红蛋白的合成以及流入末梢血管等均有促进作用。一般在贫血和低氧状态时，根据身体组织对氧的需要，促红细胞生成素的供给量将增加，但在肾脏贫血时其含量则非常低。其生成器官和机制虽尚未清楚，可是作为某肾脏因子（renalerythropoieticfactor）与血浆的基质反应产生肾小球的说法是有力的。此外，起着相当于促红细胞生成素作用的因子中，促进白细胞生成的有colonystimulatingfactor，促进血小板生成的为促血小板生成素，包括促红细胞生成素在内，统称为造血促进因子。增加红血球的数目，用于贫血、组织断离、早产儿，用在癌学和血液学方面。用于治疗慢性肾衰患者的贫血症。治疗最初1～3周观察到血细胞比容增加，且与剂量成比例，在4～6周中血细胞比容水平在不同研究中可达30%～40%之间不等，患者的生活质量提高，包括体力耐受、情绪、起居方式和性功能的提高。对慢性肾衰不需要透析的贫血患者的研究表明，使用本品也是有利的。目前促红细胞生成素的检测方法有三大类：色谱法、免疫学法、循环酶法。色谱法灵敏度高、特异性好，但样品处理、分离条件、色谱柱制备诸多变异，使其难以标准化；而且HPLC设备价格昂贵、技术条件要求高，需专门的维护人员，使其推广困难。免疫学法需要还原游离EPO形式，抗体荧光分析法和比浊法不能直接检测游离型同型半胱胺酸，只能检测血浆总糖化蛋白，用还原剂在37℃半小时卵育对血样进行还原处理。免疫学法需一小时以上才能出结果，操作步骤繁琐，因为需要进行还原处理可受一些不确定的因素影响。循环酶法过程繁琐，且检测限低、产生误差较大，价格昂贵，故得不到推广。核酸适配体是近年发展起来的一类新型识别分子，近年来受到科学家的广泛关注，大量针对重要生理活性分子的核酸适配体被筛选出来；各种基于核酸适配体的分析方法和技术已被报道；核酸适配体药物“Macugen”也已于2005年被FDA正式批准上市。SELEX技术筛选得到的寡核苷酸序列被称为适配子,国内其翻译为核酸适体、核酸适配子、核酸识体或核酸适配体等。SELEX技术是指应用化学法合成大容量的随机寡核苷酸(由两端的固定序列和中间的随机序列组成)文库,通过施加选择压力(结合靶目标，淘选与靶目标高度特异结合片段的过程),并结合体外扩增技术,经过多轮的循环选择富集,获得与靶物质高度特异结合的寡核苷酸分子,可以是RNA也可以是DNA,长度一般为25~60个核苷酸。由上可知，核酸适体与靶物质结合所呈现的高敏感性和高特异性,使其在疾病诊断中具有良好的应用前景,尽管目前成熟的临床应用报道较少,但应用适体检测球蛋白的研究却不断增多,基于适体的检测新技术也不断出现。但是目前基于核酸适体的针对于促红细胞生成素的高效特异性识别研究还很缺乏，且针对于促红细胞生成素的核酸适体及其筛选制备方法尚未见有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有的易产生操作技术误差、重复性欠佳、干扰因素很多、操作繁琐、测试成本高等不足，提供一种基于核酸适体荧光探针的促红细胞生成素EPO试剂盒及其检测方法。本专利技术的方案是通过这样实现的：一种基于核酸适体荧光探针的促红细胞生成素试剂盒，其特征在于，主要成分包括：含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液；含MgCl2的0.2M磷酸缓冲液；促红细胞生成素标准品；促红细胞生成素核酸适体荧光探针；所述促红细胞生成素核酸适体荧光探针为5'和3'两端分别标记荧光芘分子单体的核苷酸单链，该核苷酸单链序列为：gtactgcataagtagctgagtaagtcagtcga。该序列命名为EPO3。以上所述的一种基于核酸适体荧光探针的促红细胞生成素试剂盒，所述含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液为含有1~280mmol/LNH4Cl,1~34mmol/LTris,1~2mmol/LEDTA-Na2,pH7.0~7.2；所述含MgCl2的0.2M磷酸缓冲液为含有1~10mmol/LMgCl2。以上任一所述的一种基于核酸适体荧光探针的促红细胞生成素试剂盒，其特征在于，所述含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液、含MgCl2的0.2M磷酸缓冲液、促红细胞生成素标准品、促红细胞生成素核酸适体荧光探针为配制好直接使用的液体试剂或是使用前需加水溶解的干粉状态。以上所述的一种基于核酸适体荧光探针的促红细胞生成素试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于检测肝素抗凝全血或末梢血中的促红细胞生成素浓度。一种用以上任一所述基于核酸适体荧光探针的促红细胞生成素试剂盒来检测促红细胞生成素浓度的方法，其特征在于，方法步骤包括：（1）血样裂解：将血样和含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液按1:0.5~5体积比混匀，静置5~30min，再中速离心5~10min，收集上清液；（2）混合卵育：混合卵育：取20~100μl步骤1）得到的上清液和30~50ul的用含MgCl2的0.2M磷酸缓冲液，溶解促红细胞生成素核酸适体荧光探针得到的促红细胞生成素核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育5~15min，使促红细胞生成素核酸适体荧光探针与血样充分结合，得到测试液；（3）荧光检测：荧光检测仪检测步骤2）得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后，读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值；（4）结果计算：使用生物医学作图软件，参照促红细胞生成素标准样品制作的标准曲线，结合步骤3）中检测到的荧光值计算出血样中促红细胞生成素的浓度。以上所述的生物医学软件为Sigmaplot软件，于市面上可以购买到。以上所述的一种用基于核酸适体荧光探针的促红细胞生成素试剂盒来检测促红细胞生成素浓度的方法，其特征在于，所述促红细胞生成素核酸适体荧光探针试剂中促红细胞生成素核酸适体荧光探针浓度为200~400nmol/L，其特性还在于,所述促红细胞生成素核酸适体荧光探针为5'和3'两端分别标记荧光芘分子单体的核苷酸单链，该核苷酸单链序列为：gtactgcataagtagctgagtaagtcagtcga。促红细胞生成素核酸适体荧光探针不与促红细胞生成素结合时，核酸适体处于比较松散的结构，5'和3'两端的芘分子单体相互游离,荧光激发后发射波长在3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于核酸适体荧光探针的促红细胞生成素试剂盒，其特征在于，主要成分包括：含NH4Cl、Tris、EDTA‑Na2的红细胞裂解液；含 MgCl2的0.2M磷酸缓冲液；促红细胞生成素标准品；促红细胞生成素核酸适体荧光探针；所述促红细胞生成素核酸适体荧光探针为5'和3'两端分别标记荧光芘分子单体的核苷酸单链，该核苷酸单链序列为：gtactgcata agtagctgag taagtcagtc ga。
【技术特征摘要】
1.一种基于核酸适体荧光探针的促红细胞生成素试剂盒，其特征在于，主要成分包括：含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液；含MgCl2的0.2M磷酸缓冲液；促红细胞生成素标准品；促红细胞生成素核酸适体荧光探针；所述促红细胞生成素核酸适体荧光探针为5'和3'两端分别标记荧光芘分子单体的核苷酸单链，该核苷酸单链序列为：gtactgcataagtagctgagtaagtcagtcga。2.根据权利要求1所述的一种基于核酸适体荧光探针的促红细胞生成素试剂盒，其特征在于，所述含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液为含有1～280mmol/LNH4Cl,1~34mmol/LTris,1~2mmol/LEDTA-Na2,pH7.0~7.2；所述含MgCl2的0.2M磷酸缓冲液为含有1~10mmol/LMgCl2。3.根据权利要求1或2所述的一种基于核酸适体荧光探针的促红细胞生成素试剂盒，其特征在于，所述含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液、含MgCl2的0.2M磷酸缓冲液、促红细胞生成素标准品、促红细胞生成素核酸适体荧光探针为配制好直接使用的液体试剂或是使用前需加水溶解的干粉状态。4.根据权利要求1~3所述的一种基于核酸适体荧光探针的促红细胞生成素试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于检测肝素抗凝全血或末梢血中的促红细胞生成素浓度。5.一种用权利1~3任一所述基于核酸适体荧光探针的促红细胞生成素试剂盒来检测促红细胞生成素浓度的方法，其特征在于，方法步骤包括：（1）血样裂解：将血样和含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液按1:0.5~5体积比混匀，静置5~30min，再中速离心5~10min，收集上清液；（2）混合卵育：取20~100μl步骤1）得到的上清液和30~50ul的用含MgCl2的0.2M磷酸缓冲液，溶解促红细胞生成素核酸适体荧光探针得到的促红细胞生成素核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育5~15min，使促红细胞生成素核酸适体荧光探针与血样充分结合，得到测试液；（3）荧光检测：荧光检测仪检测步骤2）得到的测试液50ul，在荧光检测...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈东，
申请(专利权)人：柳州立洁科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广西;45
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