多种免疫细胞混合培养方法技术

本发明专利技术公开了多种免疫细胞混合培养方法,包括以下步骤：将制备好的DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞按细胞个数比13-17：2-4:4-6的比例混合培养，所述培养基由KBM581培养液和溶质组成，所述溶质及其在KBM581培养液中的浓度为40-400IU/mL白介素2、90-600IU/mL白介素15，在培养基中混合培养3、4天后，半量换培养基；培养到6-7天后，再次半量换培养基，并补加rhIL-450-400U/mL，继续培养，制得所述免疫细胞群。本发明专利技术将制备好的DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞按一定比例混合培养，通过试验获得最佳混合比例，最佳培养方式，获得生命周期一致的具有多重杀伤活性的免疫细胞群，极大地提高了免疫细胞的杀毒活性和细胞增殖率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，特别涉及多种免疫细胞混合培养方法。
技术介绍
树突状细胞(DendriticCells，DC)源自骨髓中的前体细胞，是已知机体内抗原呈递能力最强的细胞，比普通抗原呈递细胞强1000倍，它在负载肿瘤抗原后，能刺激T淋巴细胞分化为具有抗肿瘤活性的细胞毒性T淋巴细胞，对肿瘤细胞实施特异性杀伤。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkillers,CIK)是一类抗肿瘤抗病毒效应细胞，能在体外被诱导并大量增殖。细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxiclymphocyte,CTL)，亦叫TC细胞(cytotoxicTcell)，是白细胞的亚部，为一种特异T细胞，专门分泌各种细胞因子参与免疫作用。对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用，与自然杀伤细胞构成机体抗病毒、抗肿瘤免疫的重要防线。自然杀伤细胞(naturalkillercells，NK)是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。可非特异性直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。现行临床治疗方案中大多为单一免疫细胞疗法，由于单一免疫细胞的杀伤肿瘤活性的局限性，未达到最佳的治疗效果。在现有技术中，有将DC细胞与CIK细胞、CTL细胞、NK细胞中的一种共同培养的，DC-CIK细胞增殖能力明显高于CIK细胞，DC-CIK细胞对癌细胞的杀伤率显著高于CIK细胞。国家知识产权局申请号CN201410733771.1的专利申请文件公开了一种DC细胞与CIK细胞的共培养方法。包括步骤：1)提取单个核细胞、2)CIK细胞培养、3)DC细胞培养、DC细胞和CIK细胞混合培养、5)扩增培养。此方法在DC细胞刺激成熟，并与CIK细胞共培养后，按浓度来添加因子GM-CSF，并在培养12小时后，补加因子GM-CSF,从而保持DC细胞活性，延长DC细胞在CIK培养体系中的生存期，长时间保持DC细胞的活性。但在这个方法中仅仅将两种细胞混合培养，不能形成多重杀伤活性，限制了杀伤肿瘤细胞的活性，免疫细胞的增殖率低。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术公开了多种免疫细胞混合培养方法，将制备好的DC-CIK细胞,DC-CTL细胞,DC-NK细胞按一定比例混合培养，获得生命周期一致的具有多重杀伤活性的免疫细胞群。本专利技术是通过以下技术方法实现的，多种免疫细胞混合培养方法，包括以下步骤，将DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞按细胞个数比13-17：2-4:4-6的比例混合培养，所述培养基由KBM581培养液和溶质组成，所述溶质及其在KBM581培养液中的浓度为40-400IU/mL白介素2、90-600IU/mL白介素15，在培养基中混合培养3、4天后，半量换培养基；培养到6-7天后，再次半量换培养基，并补加rhIL-450-400U/mL，继续培养，制得所述免疫细胞群。DC细胞负载A549抗原，DC-CIK细胞、DC-CTL细胞和DC-NK细胞在培养基中混合培养后，生命周期趋于一致，生成的免疫细胞群具有多重杀伤活性，本专利技术通过大量试验得出，按照所述培养比例，按照所述步骤，免疫细胞群对肿瘤细胞的杀伤毒性大大提高，也极大地提高了免疫细胞的增殖率。白介素2即白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)，又名T细胞生长因子(Tcellgrowthfactor，TCRF)。主要由活化的CD4+T细胞和CD8+T细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子。是所有T细胞亚群的生长因子，并可促进活化B细胞增殖，故为调控免疫应答的重要因子，也参与抗体反应、造血和肿瘤监视；白介素15可在不表达白介素2的部位发挥类似白介素2的效应。试验证明，白介素2、白介素15和KBM581培养液按所述浓度组成的培养基，极大提高了免疫细胞的增殖型和杀毒活性。优选地，所述溶质还包括浓度为200-550ng/ml的因子GM-CSF、50-300ng/ml的PD-1mAb。优选地，DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞的混合培养比例优选为15:3:5。优选地，所述rhIL-4的浓度优选200U/mL，所述免疫细胞混合培养时间优选8天。优选地，所述DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞的制备包括以下步骤，1)取肺癌A549细胞一瓶，用MEM+10％FBS+双抗+1mol/L谷氨酰胺作培养基，培养至单层，用ET消化液消化，终止液终止消化，收集细胞，800-1200转/分，离心3-7min,弃上清，轻轻吹散细胞团，加培养液，按1：5比例传代，培养至单层后，收集细胞，每瓶加1-2ml生理盐水，放入-80℃冰箱或直接放入液氮，连续冻融三次，300-500转/分离心后，收获A549肺癌负载抗原，测量A549肺癌负载抗原的浓度，放4℃冰箱备用；2)取新鲜人脐血，2500-3500转/分，离心5-10min,弃血浆，用PBS按1:2稀释混匀；用另一50ml离心管，加20ml淋巴细胞分离液，所述淋巴细胞分离液d＝1.077，将离心管45°倾斜放置，在其液面上轻轻加入混匀的脐血25ml，2500-3500转/分钟，离心5-12min，吸出细胞，加PBS1500-2500转/分，离心8-12min,重复清洗一次，加KBM淋巴细胞无血清培养基，放CO2培养箱，1h后，将悬浮细胞吸入另一培养瓶，贴壁细胞用于培养DC，贴壁细胞第一天加500-1500u/mlGM-CSF、500-1500u/mlIL-4,第五天加入30-100ng/ml的脂多糖，第六天，加A549肺癌负载抗原20ng-40ng/ml，第七、八天收获DC细胞；3)用步骤2中获得的悬浮细胞培养分别得到CIK细胞、CTL细胞、NK细胞，将收获的DC细胞分别与CIK细胞、CTL细胞、NK细胞共培养得到DC-CIK细胞、CD-CTL细胞、DC-NK细胞。ET消化液将细胞集落分散成单个细胞；DC细胞按所述浓度负载A549肺癌抗原提高了混合培养的免疫细胞群的增殖率，本专利技术通过滴度测量来定量的计算A549抗原的浓度，测量滴度后，根据20-40ng/ml的浓度使DC细胞负载。优选地，上述步骤1中，肺癌A549细胞消化液消化后的离心转速为1000转/分，离心时间为5min，冻融三次后，肺癌A549细胞离心转速为400转/分。优选地，上述步骤2中新鲜人脐血的离心转速为3000转/分，离心时间为8min；淋巴细胞分离液与脐血混匀后的离心转速为3000转/分钟，离心时间为10min；吸出细胞，加PBS后的离心转速为2000转/分，离心时间为10min；所述GM-CSF的浓度为1000u/ml、IL-4的浓度为1000u/ml，所述脂多糖的浓度为50ng/ml，所述A549肺癌负载抗原的浓度为33ng/ml。优选地，所述步骤1中,还包括于培养第2天加入0.2-1mol/L的碳酸氢钠。碳酸氢钠用来构成缓冲对，提高培养基的缓冲能力。优选地，所述步骤1中，所述培养基中还包括浓度为20-90ng/ml的TNF-α、50-150ng/ml的IFN-γ。TNF-α是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对本文档来自技高网...

【技术保护点】
多种免疫细胞混合培养方法，其特征在于，包括以下步骤，将DC‑CIK细胞、DC‑CTL细胞、DC‑NK细胞按细胞个数比13‑17：2‑4:4‑6的比例混合培养，所述培养基由KBM581培养液和溶质组成，所述溶质及其在KBM581培养液中的浓度为40‑400IU/mL白介素2、90‑600IU/mL白介素15，在培养基中混合培养3、4天后，半量换培养基；培养到6‑7天后，再次半量换培养基，并补加50‑400U/mL的rhIL‑4，继续培养，制得所述免疫细胞群。

【技术特征摘要】
1.多种免疫细胞混合培养方法，其特征在于，包括以下步骤，将DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞按细胞个数比13-17：2-4:4-6的比例混合培养，所述培养基由KBM581培养液和溶质组成，所述溶质及其在KBM581培养液中的浓度为40-400IU/mL白介素2、90-600IU/mL白介素15，在培养基中混合培养3、4天后，半量换培养基；培养到6-7天后，再次半量换培养基，并补加50-400U/mL的rhIL-4，继续培养，制得所述免疫细胞群。2.根据权利要求1所述多种免疫细胞混合培养方法，其特征在于，所述溶质还包括浓度为200-550ng/ml的因子GM-CSF、50-300ng/ml的PD-1mAb。3.根据权利要求1所述多种免疫细胞混合培养方法，其特征在于，DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞的混合培养比例优选为15:3:5。4.根据权利要求1所述多种免疫细胞混合培养方法，其特征在于，所述rhIL-4的浓度优选200U/mL，所述免疫细胞混合培养时间优选8天。5.根据权利要求1所述的多种免疫细胞混合培养方法，其特征在于，所述DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞的制备包括以下步骤，1)取肺癌A549细胞一瓶，用MEM+10％FBS+双抗+1mol/L谷氨酰胺作培养基，培养至单层，用ET消化液消化，终止液终止消化，收集细胞，800-1200转/分，离心3-7min,弃上清，轻轻吹散细胞团，加培养液，按1：5比例传代，培养至单层后，收集细胞，每瓶加1-2ml生理盐水，放入-80℃冰箱或直接放入液氮，连续冻融三次，300-500转/分离心后，收获A549肺癌负载抗原，测量A549肺癌负载抗原的浓度，放4℃冰箱备用；2)取新鲜人脐血，2500-3500转/分，离心5-10min,弃血浆，用PBS按1:2稀释混匀；用另一50ml离心管，加20ml淋巴细胞分离液，所述淋巴细胞分离液d＝1.077，将离心管45°倾斜放置，在其液面上轻轻加入混匀的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓南，陈虎，吴芳春，马一盖，冯凯，贾绍昌，王蔚，
申请(专利权)人：北京昱龙盛世生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11