具有提升的酶活性的植酸酶制造技术

本发明专利技术涉及一种具有提升的酶活性的植酸酶。具体而言，本发明专利技术涉及一种具有提升的酶活性的植酸酶，其氨基酸序列为将SEQ ID NO.2的第90个位置的缬氨酸突变为苏氨酸的氨基酸序列。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请号为201310315250.X，申请日为2013年7月24日，专利技术名称为“具有提升的酶活性的植酸酶”的中国专利申请的分案申请。
本申请涉及一种植酸酶，尤指一种具有提升的酶活性的植酸酶。现有技术植酸(phyticacid)又称为肌醇六磷酸(myo-inositol(1,2,3,4,5,6)hexakisphosphate)，为植物中储存磷的主要形式，在种子中含量尤其丰富，而种子如谷类及豆类是动物饲料的主要原料。虽然种子中的植酸可成为饲养动物所需磷的重要来源，但只有反刍动物才能代谢植酸以利用其中的磷；对于非反刍动物，不能被消化代谢的植酸反而被视为抗营养物质。而植酸被视为抗营养物质的原因是植酸带有丰富的负电，易与带有正电的离子，如钙离子、镁离子、锌离子、锰离子、铜离子、铁离子螯合，再进一步与蛋白质及淀粉形成复合物，此复合物不仅阻碍金属离子的消化吸收，也影响消化酶作用而阻碍营养物质吸收。无法代谢植酸的非反刍动物需在饮食中添加无机磷或添加植酸酶(phytase)。以添加无机磷的方式，不仅成本高，无法消除抗营养反应，动物排泄物中未被代谢的植酸还会造成水质污染，破坏生态平衡。而经由植酸酶在饲料中的添加，则可降低磷酸的抗营养现象提高营养吸收，增加动物对饲料中磷的可利用性达到60％之外，还能降低磷的排出达50％。植酸酶是能够从植酸中水解出磷酸根的酶泛称，在动物、植物、微生物中皆可找到植酸酶基因的存在。植酸酶能够将植酸上的六个磷酸根依序水解出来，不同植酸酶的水解最终程度不一，水解机制也不同，若依此做为分类，植酸酶可分为组氨酸酸性磷酸酶(histidineacidphophatase)、紫色酸性磷酸酶(purpleacidphosphatase)、β螺旋桨植酸酶(β-propellerphytase)，以及半胱氨酸磷酸酶(cysteinephytase)，其中组氨酸酸性磷酸酶因为其最适pH值及作用条件较适合用于饲料添加，因此被广泛的研究。组氨酸酸性磷酸酶催化机制是藉由酸碱反应，将连接肌醇环及磷酸根的磷酸单酯键进行水解作用，释放出磷酸根，其水解步骤分为两个阶段，首先组氨酸酸性磷酸酶会利用活性区的组氨酸攻击植酸中的一个磷酸单酯键，形成磷酸-组氨酸中间体，再由活性区的天冬氨酸利用一个水分子提供质子给磷酸-组氨酸中间体中磷酸根的氧离子，释放出一个磷酸根。尽管于饲料中添加植酸酶在动物饲养上已显示可增加生产力，且使用500-1000单位活性的植酸酶可代替1克的无机磷添加及减少30-50％磷的排出，但在工业上如何使占有饲料市场60％的植酸酶能具有经济效益，为酶改造持续的目标及需求。植酸酶在饲料工业的制程及应用上，必须符合以下特性：最适酸碱值为pH2-6.5、抗酸性及抗胃蛋白酶及抗胰蛋白酶分解的特性、产品制粒时的耐热性、产品具有高活性；符合以上条件才能有效降低生产成本，应用于工业上。适合工业用的酶的取得可由自然界的生物筛选而来，但需要耗费大量时间及人力，往往获得的酶也不符合工业应用条件，需要再加以改造，而运用现有的酶再加以加强改造为较经济的方式。酶改造的策略可分为两种，一是利用定向进化，一是利用理论性的设计。定向进化包括两个步骤，一是制造具有丰富多样性的突变基因库，其次再从基因库中筛选具有特定优化特性的突变株。突变基因库的制造方法常用的有易错聚合酶链式反应(error-pronePCR)及DNA重组反应(DNAshuffling)，但庞大的突变基因库需要有大量筛选的方法，否则对于筛选上是相当耗费人力及时间的。近年来，随着可利用的蛋白质结构及序列增加，还有计算机计算软件技术的发展，可识别出蛋白质中与底物结合、活性区域、稳定结构的氨基酸，因此以此理论基础建立的有限突变基因库能更有效地筛选出优化的酶特性。因此，本申请欲藉由植酸酶的序列比对及结构分析，对一些特定的氨基酸进行基因突变，进而有效提升植酸酶在工业上应用的产业价值。
技术实现思路
本申请的目的在于改造现有植酸酶，利用序列比对、结构分析及定点突变技术，有效提升植酸酶的作用活性，借以增加植酸酶的工业应用价值。为达上述目的，本申请的一个较佳实施方式提供一种植酸酶，其氨基酸序列是将SEQIDNO.2第90个位置的缬氨酸突变成苏氨酸的氨基酸序列。编码该SEQIDNO.2的基因是从大肠杆菌(Escherichiacoli)所筛选出来的EcAppA基因，其所表现的蛋白酶为组氨酸酸性磷酸酶。该植酸酶的氨基酸序列是SEQIDNO.4的氨基酸序列。为达上述目的，本申请的一较佳实施方式为提供一种植酸酶，其氨基酸序列是将SEQIDNO.6第204个位置的天冬酰胺突变成丙氨酸或将第206个位置的丝氨酸突变成丙氨酸的氨基酸序列，以借此移除植酸酶活性区的糖基化位点。编码该SEQIDNO.6的基因系从大肠杆菌(Escherichiacoli)所筛选出来的EcAppA基因进一步经过密码子使用序列优化所得的基因，其所表现的蛋白酶为组氨酸酸性磷酸酶。该植酸酶的氨基酸序列是SEQIDNO.8或SEQIDNO.10的氨基酸序列。附图说明图1显示植酸酶EcAppA蛋白质立体结构及改造点的位置。图2显示植酸酶EcAppA的基因及氨基酸序列。图3显示定点突变所采用的引物序列。图4显示植酸酶EcAppA的Ec-V90T突变株的基因及氨基酸序列。图5显示植酸酶r-AppA的基因及氨基酸序列。图6显示植酸酶r-AppA的r-N204A突变株的基因及氨基酸序列。图7显示植酸酶r-AppA的r-S206A突变株的基因及氨基酸序列。图8显示野生型Ec-AppA与突变株Ec-V90T的植酸酶活性分析测试。图9显示野生型r-AppA与突变株r-N204A及r-S206A的植酸酶活性分析测试。具体实施方式体现本申请特征与优点的一些典型实施例将在后段的说明中详细叙述。应理解的是本申请能够在不同的实施方式上具有各种的变化，然其均不脱离本申请的范围，且其中的说明及附图在本质上是当作说明的用，而非用以限制本申请。本申请中的植酸酶基因(EcAppA)是从大肠杆菌(Escherichiacoli)所筛选出来的，其所表现的蛋白酶为组氨酸酸性磷酸酶。因为它的高活性及高度底物专一性及最适作用pH范围，均符合饲料的应用，因此具有高产业应用价值，另外，此基因已能成功的在工业生产菌株毕赤酵母(Pichiapastoris)中表达，且此酶已解出蛋白质结构。因此，此植酸酶是相当好的做为进一步酶改良的目标，故本申请欲对此活性已经相当高的植酸酶EcAppA进行改造，以进一步提升其活性。对于高活性的EcAppA，在改造上要找到增加活性的突变，机率比活性低的酶来的低，因此使用随机点突变大量筛选的成功率相对来的低；再者，即使活性增加也难有乘以倍率的增加，在筛选上不易与野生型植酸酶做区别，因此增加筛选上的困难度，所以本申请使用理智设计(rationaldesign)来提升EcAppA的活性，运用数据库可得的结构及序列加以分析，缩小筛选的目标范围，有效找到活性增加的突变株。首先，将EcAppA与同样具有高植酸酶活性的CaAppA(来自无丙二酸柠檬酸杆菌Citrobacteramalonaticus的植酸酶)及CbAppA(来自布氏柠檬酸杆菌Citrobacterbr本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种植酸酶，其氨基酸序列是将SEQ ID NO.6第204个位置的天冬酰胺突变成丙氨酸或将第206个位置的丝氨酸突变成丙氨酸的氨基酸序列，以借此移除植酸酶活性区的糖基化位点。

【技术特征摘要】
1.一种植酸酶，其氨基酸序列是将SEQIDNO.6第204个位置的天冬酰胺突变成丙氨酸或将第206个位置的丝氨酸突变成丙氨酸的氨基酸序列，以借此移除植酸酶活性区的糖基化位点。2.如权利要求1所述的植酸酶，其中编码该SEQIDNO.6的基因是从大肠杆菌Escherichiacoli所筛选出来的E...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭瑞庭，陈纯琪，吴姿慧，郑雅珊，黄建文，赖惠琳，林正言，黄婷沅，
申请(专利权)人：东莞泛亚太生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44