一种西藏木瓜活性成分的检测方法及多指标定量指纹图谱的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种西藏木瓜活性成分的检测方法及多指标定量指纹图谱的构建方法。本发明专利技术以西藏木瓜甲醇水提取物为研究对象，首次建立了HPLC‑ESI‑TOF/MS法分析测定西藏木瓜中活性成分的方法，在对多批次样品分析基础上，首次建立了西藏木瓜药材的多指标定量指纹图谱，结合相似度分析，可以实现西藏木瓜与其他品种木瓜的正确区分。本发明专利技术的研究结果可以对西藏木瓜药材的合理利用提供质量评价方法和技术支持。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种西藏木瓜活性成分的检测方法及多指标定量指纹图谱的构建方法。
技术介绍
西藏木瓜(Chaenomelesthibetica)为蔷薇科木瓜属植物，主要分布在西藏、四川等省区，具有舒经活络、和胃化湿、健胃之功效，藏医将其果实用做木瓜(藏药名赛亚)入药。《中国藏药》第一卷把西藏木瓜收录其中，但有关其质量标准仅有性状、显微和理化鉴别等方法。2015版《中国药典》一部中仅采用皱皮木瓜Chaenomelesspeciosa(Sweet)Nakai作为木瓜药材的主要来源，有关西藏木瓜的药用情况没有表述。目前，《中国药典》和相关文献中有关木瓜的质量控制也仅对其中齐墩果酸和熊果酸进行了含量测定，然而单一的指标成分难以反应中药多成分、多靶点的特点。有关西藏木瓜活性成分的分析测定和质量控制对于安全合理利用西藏木瓜资源具有重要意义。然而至今为止，西藏木瓜的质量控制仍然停留在性状鉴别和少数主要活性成分含量测定，缺乏系统的研究报道。多指标定量指纹图技术把指纹图谱技术与药效活性成分多指标定量相结合，可以更加全面地控制中药的质量。近年来，多指标定量指纹图技术在中药质量控制研究中发挥了重要作用，并且越来越多的被用于中药材及中成药的质量控制研究中。但目前还未有关于西藏木瓜多指标定量指纹图谱构建的报道，因此，有必要进行相关研究，以提高西藏木瓜的质量控制和真伪鉴别水平，以便于更好的开发利用西藏木瓜资源。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种西藏木瓜活性成分的检测方法。本专利技术的另一目的是提供一种西藏木瓜多指标定量指纹图谱的构建方法。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：一种西藏木瓜活性成分的检测方法，步骤如下：(1)对照品溶液的制备：分别制备绿原酸、香草酸、咖啡酸、藜芦酸、芸香苷、槲皮苷、金丝桃苷、齐墩果酸和熊果酸对照品溶液；(2)供试品溶液的制备：采用匀浆提取法对西藏木瓜鲜药材进行提取，制备供试品溶液；(3)采用高效液相色谱-二极管阵列检测器-电喷雾飞行时间质谱(HPLC-DAD-ESI-TOF/MS)联用技术对木瓜中的活性成分进行快速分析鉴别。步骤(1)中，制备的对照品溶液的浓度均为1mg/mL。步骤(2)中，所述匀浆提取法的操作为：向西藏木瓜鲜药材中加入甲醇溶液，水浴加热，再加入水，12000-14000r/min匀浆提取0.5-2min。西藏木瓜鲜药材、甲醇溶液和水加入量的比为1g：2ml：1ml。优选的，所述甲醇溶液的体积分数为70％。优选的，水浴加热的温度为60℃，水浴时间为10min。步骤(3)中，液相色谱条件为：乙腈作为流动相A，0.5％冰乙酸+10mM醋酸铵水溶液作为流动相B(即：以含有体积百分比为0.5％的冰乙酸和10mM醋酸铵的水溶液作为流动相B)，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～20min，7％A→8％A；20～30min，8％A→10％A；30～50min，10％A→11％A；50～65min，11％A→13％A；65～90min，13％A→15％A；90～110min，15％A→20％A；110～115min，20％A→20％A；115～140min，20％A→45％A；140～150min，45％A→45％A；150min-151min,45％A→90％A；151～156min，90％A→100％A；156～165min，100％A→100％A。进一步的，液相色谱条件中，色谱柱为AgilentZorbaxSB-C18(4.6mm×250mm，5.0μm)；流速为0.8mL/min；柱温为25℃；检测波长为280nm；进样量为10μL。步骤(3)中，质谱检测条件为：电喷雾正负离子全扫描检测；全扫描范围m/z100-1000；锥孔电压：60V；毛细管电压：5.0kV；裂解电压：100V；喷雾气压：310Kpa；干燥气流速：11.0L/min；干燥气温度：350℃。经方法学考察，本专利技术检测方法的精密度、重复性、稳定性和准确性良好，采用本专利技术的检测方法可以对西藏木瓜中的绿原酸、香草酸、咖啡酸、藜芦酸、芸香苷、槲皮苷、金丝桃苷、齐墩果酸和熊果酸等九种活性成分进行鉴别和检测。本专利技术还提供一种西藏木瓜多指标定量指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：(1)供试品溶液的制备：采用匀浆提取法对西藏木瓜鲜药材进行提取，制备供试品溶液；(2)对照品溶液的制备：分别制备绿原酸、香草酸、咖啡酸、藜芦酸、芸香苷、槲皮苷、金丝桃苷、齐墩果酸和熊果酸对照品溶液；(3)测定：分别精密量取供试品和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，并记录色谱图，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并计算各样品中目标化合物的含量；(4)用指纹图谱软件对所得图谱进行处理，即得到西藏木瓜多指标定量指纹图谱。步骤(1)中，所述匀浆提取法的操作为：向西藏木瓜鲜药材中加入甲醇，水浴加热，再加入水，12000-14000r/min匀浆提取1-2min。西藏木瓜鲜药材、甲醇溶液和水加入量的比为1g：2ml：1ml。优选的，所述甲醇溶液的体积分数为70％。优选的，水浴加热的温度为60℃，水浴时间为10min。步骤(2)中，测定的液相色谱条件为：乙腈作为流动相A，0.5％冰乙酸+10mM醋酸铵水溶液作为流动相B(即：以含有体积百分比为0.5％的冰乙酸和10mM醋酸铵的水溶液作为流动相B)，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～20min，7％A→8％A；20～30min，8％A→10％A；30～50min，10％A→11％A；50～65min，11％A→13％A；65～90min，13％A→15％A；90～110min，15％A→20％A；110～115min，20％A→20％A；115～140min，20％A→45％A；140～150min，45％A→45％A；150min-151min,45％A→90％A；151～156min，90％A→100％A；156～165min，100％A→100％A。上述方法构建得到的西藏木瓜多指标定量指纹图谱，其特征峰为30个。各色谱峰相对保留时间的RSD％均在1％以内，而相对峰面积的RSD％均在5％以内。需要说明的是，本专利技术的指纹图谱的构建方法是经过科学实验而筛选得到的，并非是本领域的常规选择，本专利技术主要对供试品溶液的制备方法，色谱条件等进行了优选。其中：1)对于供试品溶液制备方法的优化：供试品溶液的制备方法对于西藏木瓜活性成分的检测及指纹图谱的构建而言是至为关键，若供试品溶液制备方法选择不当，则可能会导致无法将西藏木瓜中的有效成分提取出来，从而无法正确的反应西藏木瓜的质量情况。本专利技术采用匀浆提取法对西藏木瓜的有效成分进行了提取，将适当溶媒加入到新鲜的生物组织中，在匀浆搅拌刀的强力作用下，细胞液中的活性成分迅速溶出到溶媒中的过程。具有操作简单、提取率高、能耗低、温度低、速度快等优点，物料破碎和有效成分的提取同步进行，特别适合于西藏木瓜有效成分的提取。本专利技术对不同提取溶剂(水、50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇)、不同匀浆转速(14000r/min，13000r/min，10000r/min，8000r/min)、不同提取时间(0.5min、1min、2min、3min)时的提取效果本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种西藏木瓜活性成分的检测方法，其特征在于，步骤如下：(1)对照品溶液的制备：分别制备绿原酸、香草酸、咖啡酸、藜芦酸、芸香苷、槲皮苷、金丝桃苷、齐墩果酸和熊果酸对照品溶液；(2)供试品溶液的制备：采用匀浆提取法对西藏木瓜鲜药材进行提取，制备供试品溶液；(3)采用高效液相色谱‑二极管阵列检测器‑电喷雾飞行时间质谱联用技术对木瓜中的活性成分进行快速分析鉴别。

【技术特征摘要】
1.一种西藏木瓜活性成分的检测方法，其特征在于，步骤如下：(1)对照品溶液的制备：分别制备绿原酸、香草酸、咖啡酸、藜芦酸、芸香苷、槲皮苷、金丝桃苷、齐墩果酸和熊果酸对照品溶液；(2)供试品溶液的制备：采用匀浆提取法对西藏木瓜鲜药材进行提取，制备供试品溶液；(3)采用高效液相色谱-二极管阵列检测器-电喷雾飞行时间质谱联用技术对木瓜中的活性成分进行快速分析鉴别。2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述匀浆提取法的操作为：向西藏木瓜鲜药材中加入甲醇溶液，水浴加热，再加入水，12000-14000r/min匀浆提取0.5-2min；西藏木瓜鲜药材、甲醇溶液和水加入量的比为1g：2ml：1ml。3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，液相色谱条件为：乙腈作为流动相A，0.5％冰乙酸+10mM醋酸铵水溶液作为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～20min，7％A→8％A；20～30min，8％A→10％A；30～50min，10％A→11％A；50～65min，11％A→13％A；65～90min，13％A→15％A；90～110min，15％A→20％A；110～115min，20％A→20％A；115～140min，20％A→45％A；140～150min，45％A→45％A；150min-151min,45％A→90％A；151～156min，90％A→100％A；156～165min，100％A→100％A。4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，质谱检测条件为：电喷雾正负离子全扫描检测；全扫描范围m/z100-1000；锥孔电压：60V；毛细管电压：5.0kV；裂解电压：100V；喷雾气压：310Kpa；干燥气流速：11.0L/min；干燥气温度：350℃。5.一种西藏木瓜多指标定量指纹图谱的构建方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵恒强，赵志国，王晓，崔莉，张敏敏，刘伟，耿岩玲，
申请(专利权)人：山东省分析测试中心，
类型：发明
国别省市：山东;37