本发明专利技术公开了一种维持DC‑CIK细胞高杀伤力的冻存保护剂，所述冻存保护剂由RPMI1640、胎牛血清和二甲基亚砜、太子参环肽B或C组成；RPMI 1640、胎牛血清和二甲基亚砜按照体积比6:3:1混合；所述太子参环肽B的浓度为7‑9μg/ml；所述太子参环肽C的浓度为4‑6μg/ml。本发明专利技术冻存保护剂能在保证DC‑CIK细胞冻存复苏率的基础上最大限度维持DC‑CIK细胞的高杀伤力，延续miRNA‑155低表达所带来的强杀伤力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫领域，涉及DC-CIK细胞的培养，具体涉及一种维持DC-CIK细胞高杀伤力的冻存保护剂。
技术介绍
申请人于2016年12月22日提交了一件DC-CIK细胞培养的专利申请，该申请公开了miRNA-155及其抑制剂在DC-CIK细胞培养方面的应用，miRNA-155可以作为药物靶标在提高DC细胞共培养增强的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力中的应用。该申请的说明书公开了miRNA-155下调表达的DC-CIK细胞比miRNA-155正常表达的DC-CIK细胞具有更高的杀伤力，而miRNA-155下调表达的DC细胞与miRNA-155正常表达的DC细胞的杀伤力基本一致，无显著性差异。这表明，miRNA-155下调并不能直接提高DC细胞对白血病细胞的杀伤力，但是miRNA-155下调的DC细胞可以通过共培养显著增强CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力。申请人还发现，太子参环肽B和太子参环肽C为miRNA-155的有效抑制剂。出于实验需要，研究人员通常需要将细胞进行冻存，以便日后复苏使用。申请人发现，miRNA-155低表达的DC-CIK细胞在冻存前虽然对白血病细胞的杀伤力非常高，但是，冻存复苏后杀伤力明显下降。这表明，传统的细胞冻存保护剂可能不适用于miRNA-155低表达DC-CIK细胞的冻存，虽然能维持其复苏率，但是不能维持其对白血病细胞的杀伤力。传统的细胞冻存保护剂多为基于DMSO的标准冻存液，由培养基、胎牛血清和DMSO组成。申请人在CIK细胞常用冻存保护剂基础上[RPMI1640、胎牛血清和二甲基亚砜按照体积比5:4:1混合，可参见文献：冻存对细胞因子诱导的杀伤细胞免疫表型及细胞内因子表达的影响，郑州大学学报(医学版)2014年1月]进行了优化研究，试图在保证DC-CIK细胞冻存复苏率的基础上最大限度维持DC-CIK细胞的高杀伤力。
技术实现思路
本专利技术旨在克服
技术介绍
中存在的不足，提供一种维持DC-CIK细胞高杀伤力的冻存保护剂，在保证DC-CIK细胞冻存复苏率的基础上最大限度维持DC-CIK细胞的高杀伤力。本专利技术通过如下技术方案得以实现：一种维持DC-CIK细胞高杀伤力的冻存保护剂，由RPMI1640、胎牛血清和二甲基亚砜、太子参环肽B或C组成。优选地，RPMI1640、胎牛血清和二甲基亚砜按照体积比6:3:1混合。优选地，所述太子参环肽B的浓度为7-9μg/ml。优选地，所述太子参环肽C的浓度为4-6μg/ml。使用上述冻存保护剂冻存DC-CIK细胞的方法：首先于4℃冰箱中放置1h，然后-20℃冰箱中放置2h，转至-80℃低温冰箱放置。本专利技术优点：本专利技术冻存保护剂能在保证DC-CIK细胞冻存复苏率的基础上最大限度维持DC-CIK细胞的高杀伤力，延续miRNA-155低表达所带来的强杀伤力。附图说明图1为不同组效应细胞复苏后存活率；图2为不同组效应细胞对白血病K562/A02细胞系的杀伤活性；图3为不同组效应细胞对白血病THP-1细胞系的杀伤活性；图4为不同组效应细胞对白血病HL-60细胞系的杀伤活性。具体实施方式为了更好地解释本专利技术的技术方案，下面结合具体实施例进一步介绍。实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，属于本领域技术人员易于获得的范畴。实施例1：冻存对miRNA-155低表达DC-CIK细胞杀伤力的影响一、实验材料1、miRNA-155inhibitor由上海吉玛制药技术有限公司提供(如下序列1)；inhibitornegativecontrol由上海吉玛制药技术有限公司提供(如下序列2)。序列1：5’-ACCCCUAUCACGAUUAGCAUUAA-3’；序列2：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。2、肿瘤细胞为白血病细胞，包括K562/A02、THP-1及HL-60细胞。二、实验方法1、效应细胞DC与CIK的分离培养(1)单个核细胞的分离：采集健康志愿者外周血20mL，预冷的PBS1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g，4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，1640培养基重悬细胞后置于37℃，5％CO2孵箱中孵育2h。(2)DC细胞的培养：单个核细胞培养2h后收集贴壁细胞，在完全培养基(1640+10％FBS)中添加GM-CSF(1000U/mL)、IL-4(1000U/mL)诱导DC生成，于37℃，5％CO2孵育箱中培养，每2天半量换液一次，换液后补充GM-CSF、IL-4，于第6d在培养基中添加TNF-α诱导DC成熟(100ng/mL)，连续培养7d，收集细胞备用。(3)CIK细胞的培养：收集单核细胞中的悬浮细胞，调整细胞密度至1×106/ml，在完全培养基(1640+10％FBS)中加入INF-γ(1000U/mL)，并于24h后添加IL-2(300U/mL)、IL-1α(l00U/mL)和抗人CD3单抗(50μg/mL)。每2-3d进行换液，并补充等量的细胞因子，连续培养7天，收集细胞备用。2、效应细胞DC的转染转染试剂为美国Invitrogen公司生产的lipofectamine2000，严格按照使用说明操作。(1)传细胞培养板：以6孔板为例，转染前一天，按1×106/ml密度接种DC细胞于6孔板，每孔加2ml培养基，使转染时贴壁细胞密度达60％。(2)用DEPC水稀释miRNA-155inhibitor或inhibitornegativecontrol(NC)，配制终浓度为20μM的存储液，分装使用。(3)配制混合液：miRNA-155inhibitor或NC混合液：取10μl上述存储液，用opti-MEM稀释，轻轻混匀，配制250μl稀释液A；lipofectamine2000稀释液：取5μllipofectamine2000，用opti-MEM稀释，轻轻混匀，配制250μl稀释液B。(4)稀释液A和稀释液B室温孵育5分钟后，将二者轻轻混匀，室温孵育20分钟，配制总体积为500μl的稀释液C。(5)将6孔板内原培养基吸去，PBS冲洗1次后吸去，每孔加入1.5mlopti-MEM。将稀释液C加入每孔，使得每孔液体总体积为2ml，miRNA-155inhibitor或NC浓度为100nM。(6)将6孔板放入细胞培养箱培养6小时，吸去含有miRNA-155inhibitor或NC的培养基，PBS冲洗1次后，加入完全培养基2ml，放入细胞培养箱中继续培养48小时。3、效应细胞DC转染后miRNA-155的表达量(qRT-PCR)3.1细胞总RNA的提取(1)吸去6孔板中的培养基，用PBS冲洗细胞2次，吸去PBS，每孔注入RNAisoPlus1ml，缓慢吹打细胞，使细胞充分裂解；(2)将裂解液吸出转入1.5mlEP管中，冰上静置5min；(3)在EP管中加入氯仿200μl，剧烈震荡混匀约15秒，冰上静置3min；然后于4℃条件下12000g/min离心15分钟；(4)离心后吸取EP管中上层水相液体500μl转入新的1.5mlEP管中，加入异丙醇500μl，颠倒混匀，冰上静置10min；然后于4℃条件下12000g/min离心10分钟；(5)将EP管中沉淀留下，加入75％乙醇1ml震荡本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种维持DC‑CIK细胞高杀伤力的冻存保护剂，其特征在于：由RPMI 1640、胎牛血清和二甲基亚砜、太子参环肽B或C组成。
【技术特征摘要】
1.一种维持DC-CIK细胞高杀伤力的冻存保护剂，其特征在于：由RPMI1640、胎牛血清和二甲基亚砜、太子参环肽B或C组成。2.根据权利要求1所述的维持DC-CIK细胞高杀伤力的冻存保护剂，其特征在于：RPMI1640、胎牛血清和二甲基亚砜按照体积比6:3:1混合。3.根据权利要求1所述的维持DC-CIK细胞高杀伤力的冻存保护剂，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：南京佰泰克生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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