一种肺干细胞培养基、注射液及其制备方法技术

本发明专利技术提供了肺干细胞的新用途，即在制备治疗肺癌及肺纤维化的药物制剂中的应用；此外本发明专利技术还提供了一种肺干细胞的注射液，其能够保证肺干细胞的稳定性，使其不易聚集成团，并且使其具有生物靶向性、适宜的渗透性及很好的物理特性，进而提高了肺癌及肺纤维化的治疗效果。并且本发明专利技术提供的肺干细胞培养方法及其专用培养基，能有效维持肺干细胞的最佳状态，引导细胞增殖，且降低培养和收获过程中肺干细胞的损伤率和死亡率，缩短生长周期；在能有效提高细胞扩增速度的同时保持肺干细胞的干性，不影响其分化性能，延长传代次数。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域，特别涉及一种肺干细胞培养基、注射液及其制备方法。
技术介绍
早在20世纪60年代发现造血干细胞后，对干细胞的研究就取得了突飞猛进的发展。干细胞是一类具有潜能的细胞，具有自我更新和高度增殖能力，按分化程度的不同，可分为全能干细胞、胚胎肝细胞、多能干细胞。成体中已经证实存在间充质干细胞、造血干细胞、肝脏干细胞和肠干细胞；他们长期存在于相应的组织中，在维持组织更新和损伤修复中起到关键的作用。目前关于肺干细胞的研究较少，并且其在相应的组织中发挥的作用人们也不得而知。此外，由于肺干细胞在保存及使用过程中稳定性差，容易发生细胞聚集成团的问题，为了更加深入地研究肺干细胞的用途，将其制成制剂的形式利于保存。现有技术中有公开将干细胞制成注射剂来使用，例如CN102008507公开了一种人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液及其制备方法，CN104857022公开了一种间充质干细胞注射液，现有技术还未发现存在注射液。再者，肺干细胞的培养过程需要特殊的培养基，如果培养基选择不当，制备的肺干细胞得率低，并且活性差。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术确定了肺干细胞与肺癌和肺纤维化存在的关联，并且提供了一种稳定性高的注射液，同时研发了一种能够提高肺干细胞得率的培养基及培养方法。本专利技术具体技术方案如下：本专利技术一方面提供了肺干细胞在治疗肺癌及肺纤维化的药物制剂中的应用。本专利技术经过试验得出，肺干细胞可用于治疗肺癌及肺纤维化，并且不易复发，治疗效果显著。本专利技术另一方面提高了肺干细胞和DC-CIK联合在制备治疗肺癌及肺纤维化的药物制剂中的应用。其中，DC-CIK和肺干细胞具有杀伤肺癌及肺纤维化细胞的作用，而肺干细胞进一步还起到修复受损伤组织的作用。DC-CIK是指与DC细胞共培养的CIK细胞。本专利技术另一方面提供了一种治疗肺癌及肺纤维化的注射液，该注射液包括肺干细胞、DC-CIK和注射混合液；每ml注射混合液含1×106-5×106个肺干细胞和6×105-7×105个DC-CIK；所述注射混合液包括以下质量百分比的成分：0.5-1％葡萄糖酸-δ-内酯、2-5％聚乙二醇、0.2-0.5％聚乙烯吡咯烷酮、0.3-0.5％磷酸烯醇式丙酮酸和2-5％葡聚糖；余量为生理盐水。本专利技术所提供的注射液可用于治疗肺癌及肺纤维化，起到修复肺组织的作用，并且不易复发，提高了患者的寿命及生活质量。本专利技术通过在注射液内加入葡萄糖酸-δ-内酯等成分后，制得的注射液稳定性高，为肺干细胞提供了一个良好的渗透压环境，利于生长，同时可防止肺干细胞的聚集，使得其不易聚集成团，从而保证了单个细胞的分离状态，利于提高细胞的存活率，并且还能够为肺干细胞提供能量，增加肺干细胞的活率，维持肺干细胞的正常代谢能力。进一步的改进，所述注射混合液还包括以下质量百分比的成分：1-3％聚谷氨酸、5-7％聚赖氨酸和0.1-0.3％粒径为15nm的磁铁矿；所述聚谷氨酸、聚赖氨酸及磁铁矿与肺干细胞制成磁性微球。本专利技术通过将肺干细胞制备磁性微球后，不但进一步提高了肺干细胞的稳定性，使其具有缓释性、适宜的渗透性、良好的组织相容性，并能够克服外来因素的干扰，提高细胞的存活能力；同时提高了肺干细胞的靶向性，使其直接作用于病灶，提高治疗效果。本专利技术另一方面还提供了注射液的制备方法，该方法包括如下步骤：1)肺干细胞的培养；2)DC-CIK的制备；3)磁性微球的制备：a)将聚谷氨酸和聚赖氨酸溶于水中，使用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制得水溶液；b)将培养的肺干细胞用磷酸盐缓冲液洗3次，然后再用磷酸盐缓冲液配置成细胞悬液；c)将经过高压灭菌的磁铁矿加入步骤a)制得的水溶液中，制得混悬液；d)将步骤b)制得的细胞悬液和步骤c)制得的混悬液混合均匀，高速剪切乳化，制得初乳；将初乳置于高压匀质机中乳化，制得乳液；将乳液超微粉碎，制得磁性微球；4)将葡萄糖酸-δ-内酯、磷酸烯醇式丙酮酸及葡聚糖混匀，并溶于生理盐水中，进行灭菌处理，制得混合液，备用；5)将步骤3)制得的磁性微球加入步骤4)制得的混合液中，并加入聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮，混合均匀，制得注射液。优选地，所述DC-CIK的制备方法如下：取新鲜人脐带血，提取单个核细胞，加入无血清培养基，放入CO2培养箱，1小时后，将悬浮细胞转入另一培养瓶，悬浮细胞用于培养CIK和NK，贴壁细胞用于培养DC；贴壁细胞第一天加入GM-CSF，IL-4，第五天加入脂多糖，第六天加入肺癌细胞抗原负载，第七八天收货DC细胞，分别和CIK混合培养，至14天收集细胞。本专利技术另一方面提供一种培养肺干细胞的培养基，该培养基由DMEM培养液和溶质组成，所述溶质及其在DMEM培养液中的浓度为12-15μg/ml乙二胺四乙酸二钠、20-30ng/ml转铁蛋白、1-2.5μg/ml赖氨酸、25-40ng/ml谷氨酸、50-66ng/ml谷胱甘肽、5-7.5μg/ml维生素C和35-40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子。进一步的改进，所述溶质还包括浓度为1-2ng/ml甘油磷酸钠和0.2-0.5ng/ml肝素钠。本专利技术所提供的肺干细胞专用培养基，在能有效提高细胞扩增速度的同时保持肺干细胞的干性，不影响其分化性能，延长传代次数。本专利技术另一方面还提供了培养肺干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：a.取胎龄为12-16周的离体胚胎，无菌取出肺，去掉薄膜、气管及支气管，并将其剪成1mm3小块，然后用含有5％双抗的生理盐水清洗三遍；b.然后向经过步骤a处理肺中加入浓度为20mg/ml的胶原酶Ⅰ和20mg/ml的胶原酶Ⅱ，37℃水浴消化30min，之后用终止液终止消化，用吸管吹打散，200目滤网过滤，1000转/分离心5min，弃上清，加入初级培养基，并用NaHCO3调节PH至7.0-7.2，放入培养瓶中，于37℃和5％CO2的条件下培养，24h；c.将培养瓶中悬浮的细胞倒入另一瓶，贴壁细胞弃掉；d.收集悬浮细胞，加入权利要求4的培养基，于37℃、5％CO2的的条件下培养5-7天，收获后得到培养的肺干细胞。其中，双抗为细胞培养添加物：青霉素及链霉素溶液，是一种含有青霉素(10000IU)和链霉素(10000μg/mL)在100倍的工作浓度的混合液。结合肺干细胞生长特性，通过大量试验总结出上述肺干细胞的培养方法及条件，能有效维持肺干细胞的最佳状态，提高肺干细胞的扩增能力。进一步的改进，所述初级培养基由RPMI1640培养液、10％胎牛血清和初级溶质组成；所述初级溶质及其在RPMI1640培养液中的浓度为：1mol/Lβ-巯基乙醇、1mol/L丙酮酸钠和1mol/L谷氨酰胺。进一步的改进，步骤d所述的培养基由DMEM培养液和溶质组成，所述溶质及其在DMEM培养液中的浓度为12-15μg/ml乙二胺四乙酸二钠、20-30ng/ml转铁蛋白、1-2.5μg/ml赖氨酸、25-40ng/ml谷氨酸、50-66ng/ml谷胱甘肽、5-7.5μg/ml维生素C和35-40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子。本专利技术另一方面还提供了治疗肺癌及肺纤维化的注射液在制备治疗肺癌及肺纤维化的药物中的应用。本专利技术的有益效果是：本专利技术提本文档来自技高网...

【技术保护点】
肺干细胞在制备治疗肺癌及肺纤维化的药物制剂中的应用。

【技术特征摘要】
1.肺干细胞在制备治疗肺癌及肺纤维化的药物制剂中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，肺干细胞和DC-CIK联合在制备治疗肺癌及肺纤维化的药物制剂中的应用。3.一种治疗肺癌及肺纤维化的注射液，其特征在于，所述注射液包括肺干细胞、DC-CIK和注射混合液；每ml注射混合液含1×106-5×106个肺干细胞和6×105-7×105个DC-CIK；所述注射混合液包括以下质量百分比的成分：0.5-1％葡萄糖酸-δ-内酯、2-5％聚乙二醇、0.2-0.5％聚乙烯吡咯烷酮、0.3-0.5％磷酸烯醇式丙酮酸和2-5％葡聚糖；余量为生理盐水。4.如权利要求3所述的治疗肺癌及肺纤维化的注射液，其特征在于，所述注射混合液还包括以下质量百分比的成分：1-3％聚谷氨酸、5-7％聚赖氨酸和0.1-0.3％粒径为15nm的磁铁矿；所述聚谷氨酸、聚赖氨酸及磁铁矿与肺干细胞制成磁性微球。5.一种权利要求4所述的治疗肺癌及肺纤维化的注射液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：1)肺干细胞的培养；2)DC-CIK的制备；3)磁性微球的制备：a)将聚谷氨酸和聚赖氨酸溶于水中，使用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制得水溶液；b)将培养的肺干细胞用磷酸盐缓冲液洗3次，然后再用磷酸盐缓冲液配置成细胞悬液；c)将经过高压灭菌的磁铁矿加入步骤a)制得的水溶液中，制得混悬液；d)将步骤b)制得的细胞悬液和步骤c)制得的混悬液混合均匀，高速剪切乳化，制得初乳；将初乳置于高压匀质机中乳化，制得乳液；将乳液超微粉碎，制得磁性微球；4)将葡萄糖酸-δ-内酯、磷酸烯醇式丙酮酸及葡聚糖混匀，并溶于生理盐水中，进行灭菌处理，制得混合液，备用；5)将步骤3)制得的磁性微球加入步骤4)制得的混合液中，并加入聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮，混合均匀，制得注射液。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓南，冯传前，吴芳春，邵来，
申请(专利权)人：北京昱龙盛世生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11