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人神经突起生长因子(Neuritin)多克隆抗体的制备方法及其应用技术

技术编号:14768202 阅读:302 留言:0更新日期:2017-03-08 12:29
本申请公开了一种Neuritin多克隆抗体的制备方法,该制备方法包括以下步骤:制备抗原Neuritin蛋白;用抗原Neuritin蛋白免疫动物;获取抗血清;Neuritin多克隆抗体的纯化。本申请还公开了一种Neuritin多克隆抗体的应用,本发明专利技术产生的Neuritin抗体应用范围广,是目前唯一一个可同时用于western blot、IF、IHC、IP的鼠Neuritin抗体。

【技术实现步骤摘要】

本申请属于生物工程领域,具体地说,涉及一种Neuritin多克隆抗体的制备方法及其应用。
技术介绍
Neuritin(神经可塑性相关蛋白,又名CPG15),是Nedivi等在海马齿状回中筛选可塑性相关基因过程中发现的一种对光线敏感,并且可以促进新皮质可塑性的新型神经营养因子,位于人类六号染色体6p24-p25之间,后由于Naeve等[NediviE,HevroniD,NaotD,IsraeliD,CitriY.Numerouscandidateplasticity-relatedgenesrevealedbydifferentialcDNAcloning[J].Nature.1993;363:718-722.]研究发现它的表达产物可以促进神经突起的快速生长而被命名为神经突起因子(Neuritin)。其开放阅读框为426bp,含有3个外显子,2个内含子,整个编码区共编码142个氨基酸,其中第1~27号氨基酸残基是信号肽,第28~115号氨基酸残基为Neuritin发挥生物学活性的中心部位,第116~142号氨基酸是GPI锚定位点。它在神经领域的功能已被多方证实可以促进神经突起生长、神经元分支和突触成熟、抑制神经元凋亡、调节突触回路形成、维持神经元存活等,并与神经系统可塑性密切相关。近年来也有研究表明Neuritin在抑郁症和阿兹海默症等神经系统疾病的治疗方面具有巨大的潜在价值。随着研究的深入,Neuritin在神经领域的重要性正逐年被更深入地发现,同时多方面的研究表明,Neuritin的功能并非仅仅局限于神经领域。Naeve等通过Northernblot方法对多种人类组织中Neuritin的mRNA表达进行检测后发现,Neuritin在脑、肺、肝组织都有表达;此外,部分研究结果表示,骨骼肌及胃癌组织中也有Neuritin的表达,并且其在胃癌组织中的表达水平显著高于其癌旁组织。2007年DavidTomLinson等人[KaramoysoyliE,BurnandRC,TomlinsonDR,GardinerNJ.Neuritinmediatesnervegrowthfactor-inducedaxonalregenerationandisdeficientinexperimentaldiabeticneuropathy[J].Diabetes.2008;57(1):181-189.]的研究表明Neuritin在STZ诱导的糖尿病大鼠体内表达含量下降,并认为Neuritin有可能是糖尿病的一个潜在治疗靶点。此外LeJan等[LeJanS,LeMeurN,CazesA,PhilippeJ,LeCunffM,etal.Characterizationoftheexpressionofthehypoxia-inducedgenesneuritin,TXNIPandIGFBP3incancer[J].FEBSLett.2006;580:3395-3400.]的研究发现,其表达水平在缺氧环境中有所升高。Neuritin在促迁移、促分化、抑制细胞凋亡、促进血管生成等方面具有其独特作用。以上研究表明Neuritin未来可能会在神经领域、肿瘤以及糖尿病等疾病的治疗中发挥重要作用。目前,市售Neuritin抗体的应用都有不同程度的局限性,如有些抗体只能识别Neuritin重组蛋白,而有些抗体只能识别细胞内源性蛋白;几乎没有抗体可以做免疫共沉淀及免疫荧光实验;且市售Neuritin抗体都为进口,货运周期长、价格昂贵、部分抗体特异性较差。以上对于科学研究形成了不便。
技术实现思路
有鉴于此,本申请针对上述的问题,提供了一种Neuritin多克隆抗体的制备方法及其应用。为了解决上述技术问题,本申请公开了一种Neuritin多克隆抗体的制备方法,包括以下步骤:1)制备抗原Neuritin蛋白冻干粉;2)用抗原Neuritin蛋白免疫动物;3)获取抗血清;4)Neuritin多克隆抗体的纯化。进一步地,步骤2)中的用抗原Neuritin蛋白免疫动物具体为:以完全佐剂乳化的蛋白为免疫原免疫雄性壮年健康SD大鼠,方法为:皮下多点注射,2mL完全佐剂乳化的蛋白/只,每点注射体积0.2mL,共免疫4次,初次免疫后3天进行第二次免疫,第二次免疫后的第25天进行第三次免疫;在第三次加强免疫后的第3-5天,对小鼠进行尾部静脉取血,分离血清,用间接ELISA法检测抗体效价;其中,完全佐剂乳化的蛋白通过以下方法制备得到:取1mL、浓度为1mg/mL的纯化后的抗原Neuritin蛋白与等体积的完全弗式佐剂混合,加入到冰浴的研钵中,充分研磨,取研磨的乳化液滴于水中观察不扩散,说明形成“油包水”,制备得到完全佐剂乳化的蛋白。进一步地,步骤3)中的获取抗血清具体为:末次免疫后一周对大鼠进行心脏采血,大鼠在采血前一天禁食;将获取的血液立即注入灭菌的EP管中,置于37℃温箱大约1h,待血液凝固后,4℃,3000r/min离心15min,弃沉淀保留上清,即获得血清;取离心后的上清,加入质量浓度2%的叠氮钠,使终浓度为0.02%,分装后保存于-20℃—-80℃。进一步地,步骤4)中的Neuritin多克隆抗体的制备具体为:4.1)免疫亲和层析柱制备:用超滤法将6-10mgNeuritin蛋白液中的溶液替换为抗体纯化的CouplingBuffer,称取300mgCNBr-sepharose4B介质,混悬于1mMHCl中,在垂熔玻璃滤器中洗15-30min;将准备好的Neuritin蛋白溶液和CNBr-sepharose4B介质混合,室温1h/4℃过夜颠倒旋转;将偶联有蛋白的介质装柱;用至少5V的Couplingbuffer清洗装好的亲和层析柱;用0.1MTris-HClbuffer,pH8.0的封闭液封闭介质2h;用至少5倍柱体积的Bindingbuffer清洗介质;用至少5倍柱体积的再生缓冲液一和再生缓冲液二分别对亲和层析柱进行清洗,共三个循环;清洗完毕将柱子保存于含有0.02%叠氮钠的1.0MNaCl溶液中,4℃冰箱储存待用;4.2)抗体纯化:将抗血清10000rpm,4℃离心,上清按照Tris-HCl:血清=1:10的比例加入pH8.0的0.1MTris-HCl;逐滴加入饱和硫酸铵溶液,至30-50%饱和度,混悬1h;10000rpm,20min,4℃离心,上清再次加入饱和硫酸铵至30-50%饱和度,混悬1h,再次离心,10000rpm,20min,弃上清;将两次离心的沉淀用200μLPBS(pH7.4)重悬,收集抗体蛋白;将抗体溶液加入制备好的亲和层析柱中,慢速上下颠倒旋转,室温2h/4℃过夜;流出柱子中的液体,即“流出液”,用2-5倍体积的Bindingbuffer清洗柱材料;用洗脱液清洗柱子,直至洗脱液中蛋白浓度为零;收集抗体洗脱液,并立即向其中加入一定量的Bindingbuffer,中和其酸性环境;将获得的抗体蛋白超滤,使最终获得的纯化后抗体保存于PBS(pH7.4)溶液中,分装,-80℃储存;用至少5倍柱体积的Bindingbuffer清洗介质;分别用至少5倍柱体积的再生缓冲液一和再生缓冲液二对亲和层析柱进行清洗,共三个循环;清洗完本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种Neuritin多克隆抗体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:1)制备抗原Neuritin蛋白冻干粉;2)用抗原Neuritin蛋白免疫动物;3)获取抗血清;4)Neuritin多克隆抗体的纯化。

【技术特征摘要】
1.一种Neuritin多克隆抗体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:1)制备抗原Neuritin蛋白冻干粉;2)用抗原Neuritin蛋白免疫动物;3)获取抗血清;4)Neuritin多克隆抗体的纯化。2.根据权利要求1所述的Neuritin多克隆抗体的制备方法,其特征在于,所述步骤2)中的用抗原Neuritin蛋白免疫动物具体为:以完全佐剂乳化的蛋白为免疫原免疫雄性壮年健康SD大鼠,方法为:皮下多点注射,2mL完全佐剂乳化的蛋白/只,每点注射体积0.2mL,共免疫4次,初次免疫后3天进行第二次免疫,第二次免疫后的第25天进行第三次免疫;在第三次加强免疫后的第3-5天,对小鼠进行尾部静脉取血,分离血清,用间接ELISA法检测抗体效价;其中,完全佐剂乳化的蛋白通过以下方法制备得到:取1mL、浓度为1mg/mL的纯化后的抗原Neuritin蛋白与等体积的完全弗式佐剂混合,加入到冰浴的研钵中,充分研磨,取研磨的乳化液滴于水中观察不扩散,说明形成“油包水”,制备得到完全佐剂乳化的蛋白。3.根据权利要求2所述的Neuritin多克隆抗体的制备方法,其特征在于,所述的步骤3)中的获取抗血清具体为:末次免疫后一周对大鼠进行心脏采血,大鼠在采血前一天禁食;将获取的血液立即注入灭菌的EP管中,置于37℃温箱大约1h,待血液凝固后,4℃,3000r/min离心15min,弃沉淀保留上清,即获得血清;取离心后的上清,加入质量浓度2%的叠氮钠,使终浓度为0.02%,分装后保存于-20℃—-80℃。4.根据权利要求3所述的Neuritin多克隆抗体的制备方法,其特征在于,所述的步骤4)中的Neuritin多克隆抗体的制备具体为:4.1)免疫亲和层析柱制备:用超滤法将6-10mgNeuritin蛋白液中的溶液替换为抗体纯化的CouplingBuffer,称取300mgCNBr-sepharose4B介质,混悬于1mMHCl中,在垂熔玻璃滤器中洗15-30min;将准备好的Neuritin蛋白溶液和CNBr-sepharose4B介质混合,室温1h/4℃过夜颠倒旋转;将偶联有蛋白的介质装柱;用至少5V的Couplingbuffer清洗装好的亲和层析柱;用0.1MTris-HClbuffer,pH8.0的封闭液封闭介质2...

【专利技术属性】
技术研发人员:黄瑾杨磊朱井玲张雯袁武梅汪海燕高蕊谌容宋晓明杨丽洪玉
申请(专利权)人:石河子大学杭州师范大学
类型:发明
国别省市:新疆;65

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