本发明专利技术公开了一种黄鳝醛酮还原酶多克隆抗体的制备方法，包括(1)黄鳝Eakr基因的克隆；(2)黄鳝Eakr基因重组表达载体的构建；(3)黄鳝Eakr重组蛋白的诱导表达和纯化；(4)多克隆抗体的制备及Western blot分析。本发明专利技术采用分子生物学和基因工程的方法，构建了黄鳝Eakr基因的重组表达载体，诱导表达，亲和层析获得纯化的重组表达蛋白。本发明专利技术的方法制备的黄鳝Eakr多克隆抗体可用于免疫组化、免疫印迹实验要求，建立体外免疫分析、研究黄鳝Eakr的功能以及黄鳝免疫荧光染色激光共聚焦显微观察，还可用于草鱼、黄颡、团头鲂、乌鳢和鲫鱼的醛酮还原酶的免疫检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体的说，涉及一种黄鳝醛酮还原酶多克隆抗体的制备方法。
技术介绍
醛酮还原酶(Aldo-ketoreductase，AKR)广泛存在于生物界，是一类依赖于NAD(P)H的分子量在34kDa-37kDa之间的单体还原酶蛋白。现报道的AKR超家族成员有16个亚家族共190多个成员，包括醛糖还原酶、酮还原酶、羟化类固醇脱氢酶、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶、多元醇脱氢酶、二氢二醇脱氢酶等多种能够代谢机体羰基化合物的酶类。在结构上，AKR超家族都包含一个(α/β)8的桶状结构、相似的辅酶结合结构域和一个高度保守的Asp，Tyr，Lys，His催化四分体。在功能上，AKR不仅在生物体应对外源性或内源性羰基化合物解毒过程中具有重要作用，还参与了生物体内氧化应激、致癌化合物的降解、糖尿病并发症及肿瘤发生等过程。通过辅酶NAD(P)H提供还原力，AKR可以将醛酮类化合物通过加氢的方式还原成相对应的醇类化合物，从而降低毒害作用。其底物包括脂肪类醛酮化合物、芳香类化合物、醛糖、儿茶酚胺、甾类、视黄醛、前列腺素、黄曲霉素等。研究发现，AKR除了参与机体的疾病发生过程，还作为重要的防御酶存在。AKR抑制剂在癌症及糖尿病并发症临床治疗等方面具有重要的意义，目前已成为研究的热点。相比哺乳动物，对于鱼类AKR的研究报道较少。国外有学者研究了苯并芘(BaP)处理罗非鱼后其肝组织AKR1A1基因的表达情况，认为罗非鱼的AKR1A1可能在BaP解毒过程中具有重要的作用。除此之外，其它鱼类的AKR基因及其功能的研究国内外尚无报道。从黄鳝(Monopterusalbus)中克隆到醛酮还原酶(Eakr)基因，对其进行体外表达、多克隆抗体制备及抗体检测的研究，对于进一步探索鱼类醛酮还原酶基因的功能具有重要意义。
技术实现思路
有鉴于此，有必要提供一种能制备出大量高质量的抗黄鳝Eakr的多克隆抗体的黄鳝Eakr多克隆抗体的制备方法。一种黄鳝Eakr多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：步骤(1)黄鳝Eakr基因的克隆：按照Trizol试剂说明书提取黄鳝总RNA，用M-MLV反转录酶合成cDNA第一链，于-80℃保存；根据GenBank数据库中已报道的AKR基因序列，设计引物，进行PCR扩增,获得黄鳝Eakr基因cDNA片段；根据SmartRACE试剂盒说明书，进行5’RACE-PCR和3’RACE-PCR扩增，获得黄鳝Eakr基因cDNA片段的5’末端和3’末端，拼接获得其全长cDNA序列；黄鳝Eakr基因的核苷酸和氨基酸序列分别如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；步骤(2)黄鳝Eakr基因重组表达载体的构建：根据黄鳝Eakr基因全长cDNA序列，设计一对特异性引物re-ex-F(5’-GCCGAATTCATGCCTGTGGTTCCCAAAG-3’)和re-ex-R(5’-CCGAAGCTTTTAGCTCCTGTACTCATCGC-3’)，分别在上、下游引物添加了EcoRI和HindIII酶切位点；以黄鳝cDNA为模板，re-ex-F和re-ex-R为引物，进行PCR扩增；将PCR产物和pET-28a(+)表达载体进行双酶切，回收纯化，连接转化大肠杆菌DH5α，获得重组表达载体pET-Eakr；步骤(3)黄鳝Eakr重组蛋白的诱导表达和纯化：将步骤(2)得到的重组表达载体pET-Eakr转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养液中培养至OD值为0.6时，加入IPTG进行诱导，培养3h。离心收集菌体，超声破碎，然后加入5×上样缓冲液进行12％SDS-PAGE电泳检测目标蛋白的表达情况；以1％的接种量将能表达重组蛋白的BL21添加到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，大量培养，诱导表达；将诱导好的菌液离心，收集菌体超声波破碎，再离心收集沉淀；将沉淀用平衡缓冲液溶解，收集上清，上样、结合、洗脱、透析，获得纯化的黄鳝Eakr重组蛋白；SDS-PAGE电泳检测纯化后的黄鳝Eakr重组蛋白；步骤(4)多克隆抗体的制备及Westernblot分析：将步骤(3)纯化的黄鳝pET-Eakr重组蛋白作为抗原，对新西兰大白兔进行8次免疫，按体积比1︰1的比例加入弗氏完全佐剂，采用背部皮下多点注射，免疫剂量为0.2mg；加强免疫选用弗氏不完全佐剂；末次免疫10天后，进行全血分离，免疫血清储存于-80℃备用。提取经IPTG诱导和未诱导的pET-Eakr重组菌的融合蛋白进行Westernblot，检测抗体的特异性；为进一步分析黄鳝pET-Eakr多克隆抗体的特异性，利用动物组织总蛋白提取试剂盒提取黄鳝肝胰组织、小肠、肌肉和脾脏4种组织的总蛋白；取50μg各组织总蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转至NC膜上。用制备的抗血清进行1：500倍稀释后作为一抗，用HRP标记的羊抗兔IgG为二抗进行多抗的特异性检测；步骤(5)免疫组化分析：采用石蜡包埋法包埋黄鳝的小肠、肝胰组织和脾脏,以6μm厚度进行切片；常规脱蜡后，用50μL的H2O2(3％)于37℃孵育10min，阻断内源过氧化物酶；将切片放入柠檬酸盐缓冲液中并加热至沸腾，20min后自然冷却；用10％山羊血清进行封闭后加入500倍稀释的兔抗Eakr抗血清37℃温育2h，用TBST洗涤3次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗，37℃孵育30min，DAB显色；苏木精复染、脱水透明及树胶封片。阴性对照以阴性血清代替一抗；步骤(6)其他鱼类Eakr同源蛋白的Westernblot分析：采用动物组织总蛋白提取试剂盒提取草鱼、黄颡、团头鲂、乌鳢和鲫鱼肝脏总蛋白，将50μg不同种鱼来源的肝脏总蛋白进行常规SDS-PAGE电泳及转膜；用自制的兔抗Eakr血清进行1：500倍稀释后作为一抗，用HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，Westernblot检测其他鱼类是否存在Eakr同源蛋白；步骤(7)多克隆抗体的效价测定：以纯化的重组蛋白为包被抗原，以第一次免疫前采集的兔血清为阴性对照，将兔抗Eakr抗体进行1：200至1：25600倍比稀释，以HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，以TMB为底物显色液，进行间接ELISA分析；以兔抗Eakr抗体OD450nm值与阴性对照血清OD450nm值的比值≥2时为阳性作为判定标准，制备的兔抗Eakr抗体最大稀释度作为该抗体的有效效价。本专利技术与现有技术相比具有如下有益效果：1)本专利技术采用分子生物学和基因工程的方法，构建了黄鳝Eakr基因的重组表达载体，诱导表达，亲和层析获得纯化的重组表达蛋白。2)本专利技术的方法制备的黄鳝Eakr多克隆抗体具有很强的特异性，可用于免疫组化、免疫印迹等实验要求，建立体外免疫分析，为深入研究黄鳝Eakr的功能提供一个重要工具。3)本专利技术制备的黄鳝Eakr多克隆抗体，可用于黄鳝免疫荧光染色激光共聚焦显微观察。4)本专利技术制备的黄鳝Eakr多克隆抗体，还可用于其他鱼类Eakr的免疫检测。附图说明图1为黄鳝Eakr基因小量表达和纯化重组蛋白SDS-PAGE电泳图；图2为黄鳝Eakr重组蛋白的Westernblot检测图；图3为以兔抗黄鳝Eakr血清为一抗的黄鳝各组织蛋白的Westernblot检测图；图4为本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种黄鳝醛酮还原酶多克隆抗体的制备方法，其特征在于,包括以下步骤：步骤(1)黄鳝Eakr基因的克隆：提取黄鳝总RNA，用M‑MLV反转录酶合成cDNA第一链，于‑80℃保存；根据GenBank数据库中已报道的AKR基因序列，设计第一对特异性引物，进行PCR扩增，获得黄鳝Eakr基因cDNA片段；进行5’RACE‑PCR和3’RACE‑PCR扩增，获得黄鳝Eakr基因cDNA片段的5’末端和3’末端，拼接获得黄鳝Eakr基因全长cDNA序列；黄鳝Eakr基因的核苷酸和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；步骤(2)黄鳝Eakr基因重组表达载体的构建：根据黄鳝Eakr基因全长cDNA序列，设计第二对特异性引物re‑ex‑F和re‑ex‑R，分别在上、下游引物添加了EcoR I和Hind III酶切位点；以黄鳝cDNA为模板，re‑ex‑F和re‑ex‑R为引物，进行PCR扩增；将PCR产物和pET‑28a(+)表达载体进行双酶切，回收纯化，连接转化大肠杆菌DH5α，获得重组表达载体pET‑Eakr；步骤(3)黄鳝Eakr重组蛋白的诱导表达和纯化：将步骤(2)得到的重组表达载体pET‑Eakr转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养液中培养至OD值为0.6时，加入IPTG进行诱导；离心收集菌体，超声破碎，然后加入5×上样缓冲液进行12％SDS‑PAGE电泳检测目标蛋白的表达情况；以1％的接种量将能表达重组蛋白的BL21添加到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，大量培养，诱导表达；将诱导好的菌液离心，收集菌体超声波破碎，再离心收集沉淀；将沉淀用平衡缓冲液溶解，收集上清，上样、结合、洗脱、透析，获得纯化的黄鳝Eakr重组蛋白；SDS‑PAGE电泳检测纯化的黄鳝Eakr重组蛋白；步骤(4)多克隆抗体的制备及Western blot分析：将步骤(3)纯化的黄鳝pET‑Eakr重组蛋白作为抗原，对新西兰大白兔进行8次免疫，按体积比1：1的比例加入弗氏完全佐剂，采用背部皮下多点注射；加强免疫选用弗氏不完全佐剂；末次免疫10天后，进行全血分离，收集兔抗血清，纯化得到黄鳝Eakr多克隆抗体。...
【技术特征摘要】
1.一种黄鳝醛酮还原酶多克隆抗体的制备方法，其特征在于,包括以下步骤：步骤(1)黄鳝Eakr基因的克隆：提取黄鳝总RNA，用M-MLV反转录酶合成cDNA第一链，于-80℃保存；根据GenBank数据库中已报道的AKR基因序列，设计第一对特异性引物，进行PCR扩增，获得黄鳝Eakr基因cDNA片段；进行5’RACE-PCR和3’RACE-PCR扩增，获得黄鳝Eakr基因cDNA片段的5’末端和3’末端，拼接获得黄鳝Eakr基因全长cDNA序列；黄鳝Eakr基因的核苷酸和氨基酸序列分别如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；步骤(2)黄鳝Eakr基因重组表达载体的构建：根据黄鳝Eakr基因全长cDNA序列，设计第二对特异性引物re-ex-F和re-ex-R，分别在上、下游引物添加了EcoRI和HindIII酶切位点；以黄鳝cDNA为模板，re-ex-F和re-ex-R为引物，进行PCR扩增；将PCR产物和pET-28a(+)表达载体进行双酶切，回收纯化，连接转化大肠杆菌DH5α，获得重组表达载体pET-Eakr；步骤(3)黄鳝Eakr重组蛋白的诱导表达和纯化：将步骤(2)得到的重组表达载体pET-Eakr转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养液中培养至OD值为0.6时，加入IPTG进行诱导；离心收集菌体，超声破碎，然后加入5×上样缓冲液进行12％SDS-PAGE电泳检测目标蛋白的表达情况；以1％的接种量将能表达重组蛋白的BL21添加到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，大量培养，诱导表达；将诱导好的菌液离心，收集菌体超声波破碎，再离心收集沉淀；将沉淀用平衡缓冲液溶解，收集上清，上样、结合、洗脱、透析，获得纯化的黄鳝Eakr重组蛋白；SDS-PAGE电泳检测纯化的黄鳝Eakr重组蛋白；步骤(4)多克隆抗体的制备及Westernblot分析：将步骤(3)纯化的黄鳝pET-Eakr重组蛋白作为抗原，对新西兰大白兔进行8次免疫，按体积比1：1...
【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，孙文秀，
申请(专利权)人：长江大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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