纤维素可及度测量的融合蛋白及其应用制造技术

技术编号:14760894 阅读:199 留言:0更新日期:2017-03-03 12:02
本发明专利技术提供了纤维素可及度测量的融合蛋白及其应用,通过将真菌纤维素酶对纤维素底物的识别功能组件与荧光蛋白相融合,从而实现准确测量纤维素对真菌纤维素酶的可及度。本发明专利技术提供的融合蛋白分子具有与真菌纤维素酶的关键组分外切葡聚糖酶类似的分子大小,而且可特异性地识别纤维素底物,并可获得可视化分析和定量测量的荧光信号,而且可以用于含水状态下底物可及度的测定,避免了传统的分析固体物质孔结构方法中底物需要干燥的步骤,因而可获得更为准确的测定结果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物化工领域,特别涉及用于纤维素可及度测量的融合蛋白及其应用
技术介绍
由于化石资源短缺日趋严峻和环境污染日益严重,以来源广泛且可再生的木质纤维素为原料生产生物能源和工业化学品受到了世界各国的广泛关注。其中以生物技术为核心的木质纤维素的生物转化已经成为生物能源开发、生物质资源加工和绿色化工过程的关键技术之一,相关研究也已成为当前工业微生物技术的一个热点和难点。然而,植物在长期进化过程中形成了复杂的木质纤维素结构以防御动物和微生物的攻击,这种木质纤维素抵抗微生物和酶降解的各种特性统称为“抗生物降解屏障”。因此在木质纤维素生物转化过程中,首先必须要对木质纤维素进行预处理以提高纤维素的可及度,这是纤维素生物转化和利用过程的关键步骤之一。纤维素的可及度是指纤维素对纤维素酶的可接触程度,是表征木质纤维素生物降解和预处理效果的重要标准。纤维素的可及度与基质的孔结构、比表面积及颗粒尺寸密切相关。而传统化学和材料科学中用于分析固体材料孔结构特性的方法亦可用于分析木质纤维素基质的孔结构。目前可用于表征木质纤维素基质孔结构特性的方法主要有BET氮气分子吸附法、溶质排斥法、差示扫描量热法和核磁共振法。但用这些方法测定纤维素可及度时,不同程度的存在某些问题。例如,BET氮气分子吸附法、差示扫描量热法和核磁共振法测量纤维素可及度时,被测量原料需要进行干燥,而干燥会导致底物孔隙特性改变。另外,由于探针分子大小与纤维素酶分子大小相差较大,因而所测定的可及度与实际可及度偏差较大。溶质排斥法虽然可以测定含水状态下木质纤维素基质的纤维素可及度,但该方法费时费力,且重复性很差,难以测定纤维素表面贡献的可及表面积。因此,要准确测定木质纤维素原料及预处理后基质中纤维素的可及度,所用探针分子需要满足如下要求:(1)探针分子需要与纤维素酶分子具有相当的尺寸大小;(2)探针分子需要可特异性识别纤维素,就像纤维素酶分子的纤维素结合元件(CBM)那样,可在热力学上自发地识别纤维素;(3)探针分子可定量分析或者能够给出可定量测量的信号。因此,本专利技术提供了一种新的纤维素可及度测量方法,通过构建与真菌纤维素酶具有类似纤维素识别功能且分子大小相当的融合蛋白探针分子,且该融合蛋白可发出定量分析的信号,从而实现准确定量测量纤维素对真菌纤维素酶的可及度。
技术实现思路
现有技术测量纤维素可及度,存在被测量材料需要干燥、测量偏差较大、测量过程费时费力和可重复性差的问题。针对以上问题,本专利技术提供一种可特异性识别纤维素且具有与真菌纤维素酶关键组分外切葡聚糖酶相当分子量大小的融合蛋白分子,以及将其用作探针分子来准确测量纤维素可及度的新方法。本专利技术提供了一种纤维素可及度测量的融合蛋白,其包含纤维素识别多肽、连接肽和荧光蛋白,或者由纤维素识别多肽、连接肽和荧光蛋白组成,其中所述连接肽位于纤维素识别多肽和荧光蛋白之间,并且所述融合蛋白的分子量为30-80kD。优选地,所述融合蛋白中的纤维素识别多肽为选自曲霉属、木霉属和青霉属中任一种真菌的纤维素酶的纤维素结合元件(CBM),优选为外切葡聚糖酶的纤维素结合元件;进一步优选地,其中所述纤维素识别多肽包含SEQIDNo:1所示的氨基酸序列,或由SEQIDNo:1所示的氨基酸序列组成。优选地,所述融合蛋白的连接肽为选自曲霉属、木霉属和青霉属中任一种真菌的外切葡聚糖酶的连接肽,优选为外切葡聚糖酶中的CBM与催化域之间的连接肽;进一步优选地,其中所述连接肽包含如SEQIDNo:2所示的氨基酸序列,或者由SEQIDNo:2所示的氨基酸序列组成。优选地,所述融合蛋白的荧光蛋白选自绿色荧光蛋白或其变体,包括蓝色荧光蛋白、蓝绿色荧光蛋白、原绿色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白、增强型黄色荧光蛋白、光活性绿色荧光蛋白等;进一步优选地,其中所述荧光蛋白为分子量为20-60kD的绿色荧光蛋白;更进一步优选地,所述融合蛋白中包含1-3个绿色荧光蛋白;再进一步优选地,其中所述荧光蛋白包含SEQIDNo:3所示的氨基酸序列,或者由SEQIDNo:3所示的氨基酸序列组成。本专利技术提供了一种核酸分子,其编码所述的融合蛋白。本专利技术提供了一种重组质粒,其包含所述的核酸分子;进一步优选地,所述重组质粒的表达载体选自大肠杆菌pET28a载体。本专利技术还提供了一种构建所述重组质粒的方法,其包括以下步骤:(1)设计并合成所述的核酸分子序列,使得其所表达的融合蛋白的分子量为30-80kD;(2)PCR扩增所合成的核酸分子序列,优选地,所使用的扩增引物如SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示;以及(3)将步骤(2)中所扩增的产物回收并连接到大肠杆菌表达载体上,挑选出阳性克隆。本专利技术还提供了一种表达所述融合蛋白的方法,其包括以下步骤:(1)构建前述重组质粒;以及(2)将步骤(1)中所构建的重组质粒转化到大肠杆菌表达菌株中,挑选出阳性克隆,并且诱导培养所述的阳性克隆表达融合蛋白;优选地,所述诱导培养条件如下:诱导剂,终浓度为1mMIPTG;诱导温度,30℃;诱导时间,6h。本专利技术还提供了利用所述融合蛋白来测量纤维素可及度的方法;优选地,所述方法包括以下步骤:将1-100mg/ml的底物悬浮在pH4至9的缓冲溶液中,加入1至20μg/ml所述融合蛋白,于10至40℃下反应10至180分钟,测定吸附前后液相荧光强度变化,由此计算出底物的纤维素可及度。优选地,本专利技术提供的方法可用于测定纯的纤维素或者经预处理后的木质纤维素中纤维素的可及度。经过实验,用本专利技术提供的融合蛋白对木质纤维素的可及度进行测量,与传统方法相比,可以更准确地测定纤维素的可及度。此外,为避免融合蛋白表达不完全,以及提高融合蛋白的表达量和稳定性,所述融合蛋白可以以CBM-GFP或者GFP-CBM的形式表达。本专利技术的优点在于:1、本专利技术提供的融合蛋白含有真菌纤维素酶的纤维素识别组件(CBM),可特异性地识别纤维素底物。2、本专利技术提供的融合蛋白探含有荧光蛋白,可以获得可视化分析和定量测量的信号。3、本专利技术提供的融合蛋白模拟了真菌纤维素酶的吸附特性。4、本专利技术提供的融合蛋白的大小与纤维素酶中的关键组分外切葡聚糖酶(CBH)类似,因而可以提高测量的精确度。5、本专利技术提供的融合蛋白可以用于含水状态下底物可及度的测定,避免了干燥带来的底物孔结构的改变。附图说明:附图1:荧光显微镜下GFP-GFP-CBM和GFP-GFP蛋白以滤纸为底物的吸附结果附图2:荧光显微镜下GFP-GFP-CBM和GFP-GFP蛋白以微晶纤维素为底物吸附结果附图3:融合蛋白分子吸附量与预处理后麦秆纤维素酶解性能的关系具体实施方式为了更详细地说明本专利技术,给出下述制备实例。但本专利技术的范围并不局限于此。实施例1大肠杆菌重组质粒pET28a-GFP2-CBM的构建根据Genebank中GFP基因、CBM基因的序列,设计两个GFP与CBM融合蛋白的基因序列并合成于pUC57-simple载体上。根据融合蛋白GFP2-CBM的基因序列及大肠杆菌表达载体pET28a上多克隆位点的特征,设计合成以下两条引物:GFP_Fe:5’-GACgaattcATGCGTAAAGGCGAAGAGCTGTTC-3’CBM_Rh:5’-GACaagcttTTACAAGCACT本文档来自技高网
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纤维素可及度测量的融合蛋白及其应用

【技术保护点】
用于测量纤维素对纤维素酶可及度的融合蛋白,其包含纤维素识别多肽、连接肽和荧光蛋白,或者由纤维素识别多肽、连接肽和荧光蛋白组成,其中所述连接肽位于纤维素识别多肽和荧光蛋白之间,并且所述融合蛋白的分子量为30‑80 kD。

【技术特征摘要】
1.用于测量纤维素对纤维素酶可及度的融合蛋白,其包含纤维素识别多肽、连接肽和荧光蛋白,或者由纤维素识别多肽、连接肽和荧光蛋白组成,其中所述连接肽位于纤维素识别多肽和荧光蛋白之间,并且所述融合蛋白的分子量为30-80kD。2.如权利要求1所述的融合蛋白,其中所述纤维素识别多肽为选自曲霉属、木霉属和青霉属中任一种真菌的纤维素酶的纤维素结合元件(CBM),优选为外切葡聚糖酶的纤维素结合元件;优选地,其中所述纤维素识别多肽包含SEQIDNo:1所示的氨基酸序列,或由SEQIDNo:1所示的氨基酸序列组成。3.如权利要求1至2中任一项所述的融合蛋白,其中所述连接肽为选自曲霉属、木霉属和青霉属中任一种真菌的外切葡聚糖酶的连接肽,优选为外切葡聚糖酶中的CBM与催化域之间的连接肽;优选地,其中所述连接肽包含如SEQIDNo:2所示的氨基酸序列,或者由SEQIDNo:2所示的氨基酸序列组成。4.如权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白,其中所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白或其变体,包括蓝色荧光蛋白、蓝绿色荧光蛋白、原绿色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白、增强型黄色荧光蛋白、光活性绿色荧光蛋白等;优选地,其中所述荧光蛋白为分子量为20-60kD的绿色荧光蛋白;优选地,所述融合蛋白中包含1-3个绿色荧光蛋白;更优选地,其中所述荧光蛋白包含SEQIDNo:3所示的氨基酸序列,或者由SEQIDNo:3所示的氨基酸序列组成。5.核酸分子,其编码权利要求1至4中任一项所述的融合蛋白。...

【专利技术属性】
技术研发人员:赵雪冰李恬欧先金刘德华
申请(专利权)人:东莞深圳清华大学研究院创新中心清华大学
类型:发明
国别省市:广东;44

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