一种用于微生物法定量检测维生素B12的微孔板、其试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种用于微生物法定量检测维生素B12的微孔板、试剂盒及其制备方法。本发明专利技术通过在制备中加入海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液保护剂，以及改进菌液的干燥方法，降低了试剂盒中的菌种损失，提高了维生素B12检测结果的准确性。经活菌计数，上述方法制备的微孔板中的德氏乳杆菌干燥泡沫中保存的活性菌种数，均超过了所添加菌液中菌种总数的90％(普通冷冻干燥法至少损失约20％的菌种)。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于微生物法定量检测维生素B12的微孔板、其试剂盒及其制备方法，属于微生物法检测领域。
技术介绍
目前，国内外关于维生素B12的检测方法都比较复杂，一般有微生物法、高效液相法和酶联免疫法。其中，高效液相法检测的下限较微生物法要高出很多，精度较好，但是需要昂贵的精密仪器和试剂，样品处理过程较为复杂，难以在生产上进行推广应用；另外，酶联免疫法检测结果与实际数值出入较大。而微生物法可灵敏地检测出具有生物活性的维生素B12，这是微生物法区别于其他方法的最大特点及优势。现有的微生物方法利用德氏乳杆菌(Lactobacillusleichmannii)对维生素B12的特异性和灵敏性，定量测定出试样中维生素B12的含量。在测定用培养基中供给除维生素B12以外的所有营养成分，这样微生物生长产生的透光率就会同标准曲线工作液及未知待测溶液中维生素B12的含量相对应；以不同浓度标准溶液的透光率相对于各浓度水平标准物质的浓度绘制标准曲线，根据标准曲线即可计算出试样中维生素B12的含量。但是包被有德氏乳杆菌的试剂盒却存在诸多缺陷，现有方法在-80℃使微孔板中的微生物悬浮液冷冻休眠，然后将微孔板中的微生物团在真空下冷冻干燥。一些微生物为了适应不利环境，发生变异或重组，因此加入水或样品后，有些微生物在无维生素的条件下仍能生长，导致高检测背景，而且在个别情况下还会导致错误结果。另外，现有方法采用在真空下冷冻干燥，还可导致至少约20％的菌种损失。因此，需要进一步改进微生物方法利用德氏乳杆菌(Lactobacillusleichmannii)对维生素B12检测的方法。专利
技术实现思路
为了克服上述现有方法的不足，本专利技术提供一种用于微生物法定量检测维生素B12的微孔板，可减少菌种损失，提高检测结果的准确性。本专利技术的另一目的在于提供上述微孔板的制备方法。本专利技术的还一目的在于提供包含该微孔板的试剂盒。本专利技术的再一目的在于提供一种用于微生物法定量检测维生素B12的试剂盒的制备方法。为了实现上述目的，本专利技术所述的一种用于微生物法定量检测维生素B12的微孔板，其由如下步骤制备而成：1)活化德氏乳杆菌，将活化后的德氏乳杆菌菌株接种到乳杆菌肉汤培养基中，32-40℃培养18-24h，2000转/min离心2-3min，弃去上清液；2)加入9-11ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀后离心2-3min，弃去上清液，重复前述操作一次，然后再加入9-11ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀，制得菌悬液；吸1-2ml菌悬液至10ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液中，混匀制成测试菌液；3)将所述测试菌液2-12μl添加至微孔板各孔中，分别在25mTorr、50mTorr、500mTorr、5Torr、50Torr、200Torr的低真空环境下稍稍加热测试菌液，使测试菌液在25℃-35℃的温度条件下沸腾而产生泡沫，并在所述低真空环境和室温下蒸发干燥24-72h，或者冷冻后再以升华的方式干燥24-72h。其中，步骤1)中的活化德氏乳杆菌采用活化方式：将11g脱脂奶粉加入89ml蒸馏水中，混匀，115℃灭菌15分钟，即为液体培养基；将0.1-0.4g粉末德氏乳杆菌菌株加入10ml所述液体培养基中，36±1℃培养直至凝乳，得凝乳状菌种，放置于0--4℃保存；将0.1-0.4ml上步骤中培养好的凝乳状菌种加入10ml所述液体培养基中，36±1℃培养直至凝乳；重复几次上一步骤，不同的是每次使用的菌种均是上一步骤获得的培养物，待凝乳时间稳定后表明菌种已活化好。所述德氏乳杆菌菌株为德氏乳杆菌ATCC7830。步骤2)中海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液中，各自的浓度分别为190-210mM、9-11mM。为了实现本专利技术的另一目的，提供一种制备用于微生物法定量检测维生素B12的微孔板的方法，其由如下步骤制备而成：1)活化德氏乳杆菌，将活化后的德氏乳杆菌菌株接种到乳杆菌肉汤培养基中，32-40℃培养18-24h，2000转/min离心2-3min，弃去上清液；2)加入9-11ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀后离心2-3min，弃去上清液，重复前述操作一次，然后再加入9-11ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀，制得菌悬液；吸1-2ml菌悬液至10ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液中，混匀制成测试菌液；3)将所述测试菌液2-12μl添加至微孔板各孔中，分别在25mTorr、50mTorr、500mTorr、5Torr、50Torr、200Torr的低真空环境下稍稍加热测试菌液，使测试菌液在25℃-35℃的温度条件下沸腾而产生泡沫，并在所述低真空环境和室温下蒸发干燥24-72h，或者冷冻后再以升华的方式干燥24-72h，从而制得定量检测维生素B12用微孔板。其中，步骤1)中的活化德氏乳杆菌采用活化方式：将11g脱脂奶粉加入89ml蒸馏水中，混匀，115℃灭菌15分钟，即为液体培养基；将0.1-0.4g粉末德氏乳杆菌菌株加入10ml所述液体培养基中，36±1℃培养直至凝乳，得凝乳状菌种，放置于0--4℃保存；将0.1-0.4ml上步骤中培养好的凝乳状菌种加入10ml所述液体培养基中，36±1℃培养直至凝乳；重复几次上一步骤，不同的是每次使用的菌种均是上一步骤获得的培养物，待凝乳时间稳定后表明菌种已活化好。所述德氏乳杆菌菌株为德氏乳杆菌ATCC7830。步骤2)中海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液中，各自的浓度分别为190-210mM、9-11mM。本专利技术还提供一种包含上述微孔板的试剂盒。所述试剂盒，还包含维生素B12标准品、维生素B12测试培养基以及无菌水。具体地说，本专利技术所述试剂盒，包含包被有德氏乳杆菌ATCC7830菌株的上述微孔板、3×0.012μg维生素B12标准品、3×(0.5-0.6)g维生素B12测试培养基(蛋白胨10g/L、牛肉提取物10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、聚山梨醇酯801g/L、柠檬酸铵2g/L、醋酸钠5g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.05g/L、磷酸氢二钾2g/L)以及3×30ml无菌水。本专利技术所述的试剂盒的制备方法，其包括如下步骤：a.先制备包含包被有德氏乳杆菌菌株的微孔板：1)活化德氏乳杆菌，将活化后的德氏乳杆菌菌株接种到乳杆菌肉汤培养基中，32-40℃培养18-24h，2000转/min离心2-3min，弃去上清液；2)加入9-11ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀后离心2-3min，弃去上清液，重复前述操作一次，然后再加入9-11ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀，制得菌悬液；吸1-2ml菌悬液至10ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液中，混匀制成测试菌液；3)将所述测试菌液2-12μl添加至微孔板各孔中，分别在25mTorr、50mTorr、500mTorr、5Torr、50Torr、200Torr的低真空环境下稍稍加热测试菌液，使测试菌液在25℃-35℃的温度条件下沸腾而产生泡沫，并在所述低真空环境和室温下蒸发干燥24-72h，或者冷冻后再以升华的方式干燥24-72h，从而制得定量检测维生素B12用微孔板；b.然后制备包含维生素B12标准品及维生素B12测试培养基(蛋白胨10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于微生物法定量检测维生素B12的微孔板，其特征在于，其由如下步骤制备而成：1)活化德氏乳杆菌，将活化后的德氏乳杆菌菌株接种到乳杆菌肉汤培养基中，32‑40℃培养18‑24h，2000转/min离心2‑3min，弃去上清液；2)加入9‑11ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀后离心2‑3min，弃去上清液，重复前述操作一次，然后再加入9‑11ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀，制得菌悬液；吸1‑2ml菌悬液至10ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液中，混匀制成测试菌液；3)将所述测试菌液2‑12μl添加至微孔板各孔中，分别在25mTorr、50mTorr、500mTorr、5Torr、50Torr、200Torr的低真空环境下稍稍加热测试菌液，使测试菌液在25℃‑35℃的温度条件下沸腾而产生泡沫，并在所述低真空环境和室温下蒸发干燥24‑72h，或者冷冻后再以升华的方式干燥24‑72h。

【技术特征摘要】
1.一种用于微生物法定量检测维生素B12的微孔板，其特征在于，其由如下步骤制备而成：1)活化德氏乳杆菌，将活化后的德氏乳杆菌菌株接种到乳杆菌肉汤培养基中，32-40℃培养18-24h，2000转/min离心2-3min，弃去上清液；2)加入9-11ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀后离心2-3min，弃去上清液，重复前述操作一次，然后再加入9-11ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀，制得菌悬液；吸1-2ml菌悬液至10ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液中，混匀制成测试菌液；3)将所述测试菌液2-12μl添加至微孔板各孔中，分别在25mTorr、50mTorr、500mTorr、5Torr、50Torr、200Torr的低真空环境下稍稍加热测试菌液，使测试菌液在25℃-35℃的温度条件下沸腾而产生泡沫，并在所述低真空环境和室温下蒸发干燥24-72h，或者冷冻后再以升华的方式干燥24-72h。2.根据权利要求1所述的微孔板，其特征在于，步骤1)中的活化德氏乳杆菌采用活化方式为：将11g脱脂奶粉加入89ml蒸馏水中，混匀，115℃灭菌15分钟，即为液体培养基；将0.1-0.4g粉末德氏乳杆菌菌株加入10ml所述液体培养基中，36±1℃培养直至凝乳，得凝乳状菌种，放置于0--4℃保存；将0.1-0.4ml上步骤中培养好的凝乳状菌种加入10ml所述液体培养基中，36±1℃培养直至凝乳；重复几次上一步骤，不同的是每次使用的菌种均是上一步骤获得的培养物，待凝乳时间稳定后表明菌种已活化好。3.根据权利要求1所述的微孔板，其特征在于，所述德氏乳杆菌菌株为德氏乳杆菌ATCC7830。4.根据权利要求1所述的微孔板，其特征在于，步骤2)中海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液中，各自的浓度分别为190-210mM、9-11mM。5.制备权利要求1-4任意一项所述微孔板的方法，其由如下步骤制备而成：1)活化德氏乳杆菌，将活化后的德氏乳杆菌菌株接种到乳杆菌肉汤培养基中，32-40℃培养18-24h，2000转/min离心2-3min，弃去上清液；2)加入9-11ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀后离心2-3min，弃去上清液，重复前述操作一次，然后再加入9-11ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀，制得菌悬液；吸1-2ml菌悬液...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙飞，高天垒，卜庆婧，
申请(专利权)人：北京中检葆泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11