本发明专利技术涉及细胞培养基领域，具体涉及一种无血清无动物源添加的昆虫细胞培养基。本发明专利技术培养基主要由以下组分组成：基础培养基，葡萄糖，无机盐，维生素，L‑精氨酸，L‑天冬酰胺，L‑甘氨酸，L‑组氨酸，L‑异亮氨酸，L‑亮氨酸，L‑赖氨酸，L‑蛋氨酸，L‑苏氨酸，L‑色氨酸，L‑结氨酸，L‑脯氨酸，L‑谷氨酰胺，酵母提取物，重组胰岛素，苹果酸，延胡索酸，胆固醇，亚油酸，大豆磷脂，腐胺，谷胱甘肽，甘油和果聚糖；本发明专利技术培养基能促进昆虫细胞的生长，适用于昆虫细胞的大规模培养和重组蛋白的表达。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞培养基领域，具体涉及一种无血清无动物源添加的昆虫细胞培养基。
技术介绍
Sf-9细胞和HighFive细胞，是杆状病毒表达系统的宿主细胞。在应用于蛋白的表达与制备纯化中，有着许多的优点，包括：表达的重组蛋白能正确折叠，并形成二硫键；翻译后可进行修饰加工如糖基化、磷酸化、酰胺化及信号肽切割等，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白；与其他真核表达系统相比，杆状病毒表达系统可以高效表达外源基因，表达量最高可达被感染昆虫细胞总蛋白量的50％；可以容纳大片段外源基因。目前，国内的生产工艺多采用Grace培养基或者IPL-41培养基添加5-10％的小牛血清培养，或者用商业化无血清培养基如SF900II再添加适当血清培养。很多商品号称是无血清培养基，但是，很难做到完全脱离血清培养。另外，由于目前国内血清供应日益紧张伴随着价格不断走高，对国内生物抗体生产企业产生了明显的限制。此外，从生产的角度来讲，血清中含有大量成分复杂的蛋白质，这极不利于疫苗、类病毒颗粒、细胞因子和单克隆抗体等生物制品的下游纯化分离，同时血清所含的化学成分不确定，血清也存在批次稳定性问题，而且还容易引起细菌、真菌、病毒和支原体污染。因此，尽量不用或少用血清成为昆虫细胞培养的趋势，现有技术常通过添加牛血清白蛋白、转铁蛋白、胰岛素等动物源成分，来降低血清的添加量，但是动物源成分的蛋白质对生物制品(如疫苗)的安全性有很大影响，所以迫切需要一种能代替血清功能的细胞培养添加物。既能够使细胞快速生长，保持较高的活力，又减少了污染的可能，提高细胞产品的稳定性，同时减少动物来源的蛋白组分含量，利于后期纯化工艺，降低生产成本。目前，巴斯福股份公司申请的中国专利申请(公开号CN1498267A)，其所生产的培养基为液体培养基，对于运输和放菌要求极高，并且价格昂贵，不适合我国的目前的培养基发展状况。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种无血清无动物源添加的昆虫细胞培养基。本专利技术无血清无动物源添加的昆虫细胞培养基既能够使细胞快速生长，保持较高的活力，又减少了污染的可能，提高细胞产品的稳定性，同时减少动物来源的蛋白组分含量，利于后期纯化工艺，降低生产成本。本专利技术无血清无动物源添加的昆虫细胞培养基通过以下技术方案实现：一种无血清无动物源添加的昆虫细胞培养基，主要由以下组分及其浓度组成：基础培养基6-8g/L，葡萄糖6.5-8g/L，无机盐0.7-1.5g/L，维生素4-9g/L，L-精氨酸4-6mM，L-天冬酰胺3-5mM，L-甘氨酸7-10mM，L-组氨酸1.5-3mM，L-异亮氨酸8.5-9mM，L-亮氨酸7-9mM，L-赖氨酸4-9mM，L-蛋氨酸0.35-0.54mM，L-苏氨酸4.5-7.5mM，L-色氨酸0.69-1.2mM，L-结氨酸2.87-4.32mM，L-脯氨酸7.38-8.42mM，L-谷氨酰胺7-14.5g/L，酵母提取物10-50g/L，重组胰岛素2-25mg/L，苹果酸0.4-1.8g/L，延胡索酸0.1-0.8g/L，胆固醇1-20mg/L，亚油酸1-10mg/L，大豆磷脂0.1-20g/L，腐胺0.1-10g/L，谷胱甘肽0.3-0.6g/L，甘油0.1-1g/L和果聚糖4-7.5g/L。优选地，所述维生素包括生物素0.15-2.75mg/L，维生素B120.3-0.42mg/L，核黄素1.5-2.3mg/L，对氨基苯甲酸0.21-0.42mg/L，泛酸7-8mg/L，维生素B10.69-0.74mg/L，叶酸0.2-0.3mg/L和氯化胆碱16-18mg/L。优选地，所述无机盐由：氯化钠20-23mM，磷酸二氢钠10-12mM，柠檬酸钠5-7mM，亚硒酸钠12-15mM，氯化钾5-8mM，硫酸钾4-6mM，氯化铝1-3.5mM，硫酸锌10-20mM，四水氯化锰1-5mM，钼酸铵0.3-0.7mM组成。优选地，所述无血清无动物源添加的昆虫细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：基础培养基7.5g/L，葡萄糖7.2g/L，氯化钠21.5mM，磷酸二氢钠11mM，柠檬酸钠5.5mM，亚硒酸钠13.5mM，氯化钾6mM，硫酸钾5.23mM，氯化铝2.75mM，硫酸锌14.5mM，四水氯化锰3.2mM，钼酸铵0.67mM，生物素1.75mg/L、维生素B120.38mg/L，核黄素1.82mg/L，对氨基苯甲酸0.35mg/L，泛酸7.6mg/L，维生素B10.71mg/L，叶酸0.27mg/L，氯化胆碱17mg/L，L-精氨酸5.6mM，L-天冬酰胺4.75mM，L-甘氨酸8.2mM，L-组氨酸2.45mM，L-异亮氨酸8.65mM，L-亮氨酸7.68mM，L-赖氨酸8.15mM，L-蛋氨酸0.49mM，L-苏氨酸7.2mM，L-色氨酸1.14mM，L-结氨酸3.32mM，L-脯氨酸8.12mM，L-谷氨酰胺13.75g/L，酵母提取物45g/L，重组胰岛素16mg/L，胆固醇8.5mg/L，亚油酸7.5mg/L，大豆磷脂11g/L，腐胺7.3g/L，谷胱甘肽0.45g/L，甘油0.79g/L和果聚糖5.45g/L。优选地，所述培养基中基础培养为Grace或IPL-41培养基。糖类是大部分昆虫细胞首要的能源和碳源，葡萄糖是昆虫细胞的主要代谢能源；果聚糖(fructan)是果糖基转移酶催化的由蔗糖与一个或多个果糖分子连接而成的水溶性和黏性的高分子多糖，具有多种生理功能和生物活性。本专利技术将果聚糖用于昆虫细胞培养基中，可以起到维持昆虫细胞渗透压的作用。氨基酸是细胞生长所需的另一类重要物质，其中有14种必需氨基酸，细胞本身不能合成，必须由培养基提供。非必需氨基酸有谷氨酰胺、甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等，其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质的重要材料，缺少谷氨酰胺会影响到细胞的生长速度，几乎所有的昆虫细胞对谷氨酰胺都有较高的要求。本专利技术根据昆虫细胞生长的特性，筛选了上述氨基酸种类，并且在限定的氨基酸范围内更有利于昆虫细胞的生长。昆虫细胞要在较高的渗透压中生长，一般为340mOsm/kg～390mOsm/kg，因而昆虫细胞培养基中无机盐浓度略高，并且各无机盐离子之间需要平衡，其中Na+/K+比例在某些细胞系中有严格的要求。本专利技术培养基中钠离子浓度为79mM-100mM，钾离子浓度为13mM-20mM，为昆虫细胞提供了适宜的渗透压，并且本专利技术技术人员意外地发现，重组蛋白在此浓度范围内能够大量表达。在有机酸中，苹果酸、延胡索酸的联合使用，能够促进昆虫细胞的生长和重组蛋白的表达。维生素是维持细胞生长的一种重要生物活性物质，在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶，对促进昆虫细胞生长、促进细胞贴附有积极作用。与现有技术相比，本专利技术至少具有如下优点：该昆虫细胞无血清无蛋白添加培养基能促进细胞快速生长，增加细胞密度，缩短倍增时间，提高细胞活力；并且本专利技术培养基组分简单明确，易于制备，成本低廉，适用于昆虫细胞的大规模培养和重组蛋白的表达。附图说明图1不同培养基中重组蛋白含量。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细说明，但这并非是对本专利技术的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种无血清无动物源添加的昆虫细胞培养基，其特征在于，主要由以下组分及其浓度组成：基础培养基6‑8g/L，葡萄糖6.5‑8g/L，无机盐0.7‑1.5g/L，维生素4‑9g/L，L‑精氨酸4‑6mM，L‑天冬酰胺3‑5mM，L‑甘氨酸7‑10mM，L‑组氨酸1.5‑3mM，L‑异亮氨酸8.5‑9mM，L‑亮氨酸7‑9mM，L‑赖氨酸4‑9mM，L‑蛋氨酸0.35‑0.54mM，L‑苏氨酸4.5‑7.5mM，L‑色氨酸0.69‑1.2mM，L‑结氨酸2.87‑4.32mM，L‑脯氨酸7.38‑8.42mM，L‑谷氨酰胺7‑14.5g/L，酵母提取物10‑50g/L，重组胰岛素2‑25mg/L，苹果酸0.4‑1.8g/L，延胡索酸0.1‑0.8g/L，胆固醇1‑20mg/L，亚油酸1‑10mg/L，大豆磷脂0.1‑20g/L，腐胺0.1‑10g/L，谷胱甘肽0.3‑0.6g/L，甘油0.1‑1g/L和果聚糖4‑7.5g/L。
【技术特征摘要】
1.一种无血清无动物源添加的昆虫细胞培养基，其特征在于，主要由以下组分及其浓度组成：基础培养基6-8g/L，葡萄糖6.5-8g/L，无机盐0.7-1.5g/L，维生素4-9g/L，L-精氨酸4-6mM，L-天冬酰胺3-5mM，L-甘氨酸7-10mM，L-组氨酸1.5-3mM，L-异亮氨酸8.5-9mM，L-亮氨酸7-9mM，L-赖氨酸4-9mM，L-蛋氨酸0.35-0.54mM，L-苏氨酸4.5-7.5mM，L-色氨酸0.69-1.2mM，L-结氨酸2.87-4.32mM，L-脯氨酸7.38-8.42mM，L-谷氨酰胺7-14.5g/L，酵母提取物10-50g/L，重组胰岛素2-25mg/L，苹果酸0.4-1.8g/L，延胡索酸0.1-0.8g/L，胆固醇1-20mg/L，亚油酸1-10mg/L，大豆磷脂0.1-20g/L，腐胺0.1-10g/L，谷胱甘肽0.3-0.6g/L，甘油0.1-1g/L和果聚糖4-7.5g/L。2.根据权利要求1所述无血清无动物源添加的昆虫细胞培养基，其特征在于，所述维生素包括生物素0.15-2.75mg/L，维生素B120.3-0.42mg/L，核黄素1.5-2.3mg/L，对氨基苯甲酸0.21-0.42mg/L，泛酸7-8mg/L，维生素B10.69-0.74mg/L，叶酸0.2-0.3mg/L和氯化胆碱16-18mg/L。3.根据权利要求1所述无血清无动物源添加的昆虫细胞培养基，其特征在于，无机盐由：氯化钠20-23mM，磷酸二氢钠10-12mM，柠檬酸钠5-7mM，亚硒酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：严志海，
申请(专利权)人：严志海，
类型：发明
国别省市：广东;44
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