牛副流感病毒3型HN蛋白核酸适配体及其筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种牛副流感病毒3型HN蛋白核酸适配体及其筛选方法，属于生物工程领域。本发明专利技术通过微孔板法不同轮次筛选获得多条HN蛋白的核酸适配体候选物，选择测序结果出现频次较高的适配体，用I‑ELAA法测定了其与HN蛋白的结合力，三条适配体W‑32、W‑33和W‑34的KD值分别为56.57±2.7nM、24.64±2.84nM和31.3±3.32nM，二级结构预测显示核酸适配体均具有稳定的颈环状或发卡状结构，说明本次筛选的三条适配体均能与HN蛋白特异、稳定的结合，可用于后续检测BPIV3抗原或抗体的酶联适配体法的建立。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种牛副流感病毒3型HN蛋白核酸适配体及其筛选方法。
技术介绍
指数富集配体系统进化技术(Systematicevolutionofligandbyexponentialenrichment,SELEX)是一种能获取与靶物质特异结合的寡核苷酸的筛选技术，筛选得到的单链DNA或RNA分子称为核酸适配体。核苷酸不仅有储存和传递遗传信息的作用，还可以通过自身特有的空间结构与其它分子相互作用。在适宜条件下，单链DNA或RNA分子会发生适应性折叠，形成发夹、凸环、四分体等结构，从而与靶物质紧密结合。因此，近年来，具有高特异性、高亲和力、高稳定性、低免疫原性、低分子量、易于合成等特点的核酸适配体，得到了广泛的应用。核酸适配体筛选方法也多种多样，如毛细管法、亲和层析、磁珠分离、微孔板法等。毛细管法是利用毛细管电泳作为分离方法的一种技术，与靶物质结合的核苷酸序列和未与靶物质结合的序列在毛细管中的迁移率不同，从而使结合序列与未结合序列分离；该方法具有快速、微量等特点，但需要特殊的仪器(毛细管电泳仪)，且比较适于筛选分子量大的分子。亲和层析分离是将靶分子通过共价键或非共价键偶联至玻璃株或树脂上，与文库作用后，结合序列会留在树脂上而不结合序列通过层析柱流走，从而达到分离的目的；该方法要求靶分子必须要有能与玻璃珠或树脂偶联的亲和标记或功能基团。微孔板法是将靶分子通过物理吸附作用结合于微孔板上，加入适配体文库孵育后弃去未结合的适配体，洗脱与靶分子结合的适配体即可；该方法适用靶分子广，对靶分子性状要求不严格，凡是能特吸附至微孔板的物质均可进行筛选。然而，对于不同的靶物质应采用适当的筛选方法，以便快速、准确地筛选到亲和力高、特异性强的适配体。为了得到牛副流感病毒3型HN蛋白高结合力和特异性的核酸适配体，我们采用了较为传统的微孔板法，进行了改进和优化。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，而提供一种牛副流感病毒3型HN蛋白核酸适配体及其筛选方法，对牛副流感病毒3型核酸适配体筛选方法进行改进和优化，该筛选方法具有适用靶分子广，对靶分子要求不严格，操作简便，节约成本等优点。同时运用该方法筛选获得的HN蛋白核酸适配体，为后续检测BPIV3抗原或抗体的酶联适配体法的建立奠定了基础。本专利技术采用如下技术方案：牛副流感病毒3型HN蛋白核酸适配体筛选方法，包括如下步骤：步骤一：设计和合成初始寡核苷酸文库及用于PCR扩增的上游引物和下游引物；步骤二，包被：吸取HN蛋白溶液包被于微孔板中；步骤三，洗板：甩去包被液，洗涤微孔板，甩干；步骤四，封闭：向微孔中加入含BSA的HEPES液，孵育；步骤五，加核酸适配体文库：甩去封闭液，用HEPEST洗涤，甩干，将溶解的初始寡核苷酸文库(使用时溶于400μLHEPES缓冲液，95℃孵育10min，迅速冰浴10min后备用)加入到封闭好的微孔中，孵育；步骤六，洗板：甩去寡核苷酸文库，洗涤微孔板，拍干孔中残留的洗涤液；步骤七，洗脱：向微孔中加入核酸洗脱液，孵育；步骤八，提取：吸出洗脱液，提取洗脱液中的核酸适配体；步骤九，PCR：对步骤八提取的核酸适配体分别进行一轮对称PCR和一轮非对称PCR；步骤十，胶回收：回收PCR产物；步骤十一，反筛：从第5轮起开始进行反筛，封闭后，将非对称PCR回收的核酸适配体加入反筛孔，孵育后将上清吸出，加入包被有HN蛋白的微孔中孵育。更进一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸适配体筛选方法，其中步骤一种所述初始寡核苷酸文库的序列如SEQIDNO.1所示，上游引物的序列如SEQIDNO.2所示，下游引物的序列如SEQIDNO.3所示.更进一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸适配体筛选方法，其中步骤二中包被具体为：吸取100μLHN蛋白溶液包被于96孔ELISA微孔板中，4℃过夜；步骤三中的洗板具体为：甩去包被液，用300μLHEPEST洗涤微孔板三次，甩干，其中所述HEPEST为含0.05％Tween20的HEPES。更进一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸适配体筛选方法，其中步骤四中所述封闭具体为：向微孔中加入200μL含3％BSA的HEPES液，37℃孵育2h。更进一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸适配体筛选方法，其中步骤五中所述加核酸适配体文库具体为：甩去封闭液，用HEPEST洗涤三次，甩干，将100uL溶解的初始寡核苷酸文库加入到封闭好的微孔中，37℃孵育1h。更进一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸适配体筛选方法，其中步骤六中所述洗板具体为：甩去寡核苷酸文库，用300μLHEPEST洗涤微孔板四次，拍干孔中残留的洗涤液；步骤七中所述洗脱具体为：向微孔中加入100μL核酸洗脱液，80℃孵育10min。更进一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸适配体筛选方法，其中步骤八中所述提取具体为：吸出洗脱液，采取酚抽提法，用25:24:1的酚：氯仿：异戊醇提取洗脱液中的核酸适配体。更进一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸适配体筛选方法，其中步骤九中所述对称PCR具体为：2×Mix25μL，WZ-031μL，WZ-041μL，适配体3μL，去离子水20μL，反应条件为95℃、10min，95℃、20s，65℃、20s，72℃、30s，15个循环，72℃、5min；所述非对称PCR具体为2×Mix25μL，WZ-031μL，WZ-040.02μL，适配体5μL，去离子水19μL，反应条件为95℃、10min，95℃、20s，65℃、20s，72℃、30s，28个循环，72℃、5min。更进一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸适配体筛选方法，其中步骤十中所述胶回收具体为：用Bioteke短片段DNA胶回收试剂盒按照说明书要求回收PCR产物。更进一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸适配体筛选方法，其中步骤十一中所述反筛具体为：从第5轮起开始进行反筛，即微孔板包被HN蛋白的同时包被无HN蛋白的包被液反筛孔，同样条件封闭后，将非对称PCR回收的核酸适配体加入反筛孔，37℃孵育30min后将上清吸出，加入包被有HN蛋白的微孔中孵育1h与现有技术相比，本专利技术的有益效果：本专利技术对传统的微孔板法进行了改进和优化，得到了与牛副流感病毒3型HN蛋白具有高结合力和特异性的核酸适配体。其中微孔板分离利用了ELISA酶标板能吸附靶分子的功能从而达到分离的目的。将靶分子通过物理吸附作用结合于微孔板上，与适配体文库孵育后弃去未结合的适配体，加入变性溶液从微孔板内洗脱下与靶分子结合的核酸适配体。该方法适用靶分子广，对靶分子性状要求不严格，凡是能特吸附到微孔板的物质均可进行筛选。此外，该方法不需要使用特殊仪器设备和材料，操作简便，节约成本。附图说明图1为第1轮筛选的对称PCR与非对称PCR琼脂糖电泳结果，其中，1：对称PCR样品；2：非对称PCR样品；M：低分子量marker(50-400bp)N：阴性对照；图2为第2轮筛选的对称PCR与非对称PCR琼脂糖电泳结果，其中，1：对称PCR样品；2：非对称PCR样品；M：低分子量marker(50-400bp)N：阴性对照；图3为第9轮筛选的对称PCR与非对称PCR琼脂糖电泳结果本文档来自技高网...

【技术保护点】
牛副流感病毒3型HN蛋白核酸适配体筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：设计和合成初始寡核苷酸文库及用于PCR扩增的上游引物和下游引物；步骤二，包被：吸取HN蛋白溶液包被于微孔板中；步骤三，洗板：甩去包被液，洗涤微孔板，甩干；步骤四，封闭：向微孔中加入含BSA 的HEPES液，孵育；步骤五，加核酸适配体文库：甩去封闭液，用HEPEST洗涤，甩干，将溶解的初始寡核苷酸文库加入到封闭好的微孔中，孵育；步骤六，洗板：甩去寡核苷酸文库，洗涤微孔板，拍干孔中残留的洗涤液；步骤七，洗脱：向微孔中加入核酸洗脱液，孵育；步骤八，提取：吸出洗脱液，提取洗脱液中的核酸适配体；步骤九，PCR：对步骤八提取的核酸适配体分别进行一轮对称PCR和一轮非对称PCR；步骤十，胶回收：回收PCR产物；步骤十一，反筛：从第5轮起开始进行反筛，封闭后，将非对称PCR回收的核酸适配体加入反筛孔，孵育后将上清吸出，加入包被有HN蛋白的微孔中孵育。

【技术特征摘要】
1.牛副流感病毒3型HN蛋白核酸适配体筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：设计和合成初始寡核苷酸文库及用于PCR扩增的上游引物和下游引物；步骤二，包被：吸取HN蛋白溶液包被于微孔板中；步骤三，洗板：甩去包被液，洗涤微孔板，甩干；步骤四，封闭：向微孔中加入含BSA的HEPES液，孵育；步骤五，加核酸适配体文库：甩去封闭液，用HEPEST洗涤，甩干，将溶解的初始寡核苷酸文库加入到封闭好的微孔中，孵育；步骤六，洗板：甩去寡核苷酸文库，洗涤微孔板，拍干孔中残留的洗涤液；步骤七，洗脱：向微孔中加入核酸洗脱液，孵育；步骤八，提取：吸出洗脱液，提取洗脱液中的核酸适配体；步骤九，PCR：对步骤八提取的核酸适配体分别进行一轮对称PCR和一轮非对称PCR；步骤十，胶回收：回收PCR产物；步骤十一，反筛：从第5轮起开始进行反筛，封闭后，将非对称PCR回收的核酸适配体加入反筛孔，孵育后将上清吸出，加入包被有HN蛋白的微孔中孵育。2.根据权利要求1所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸适配体筛选方法，其特征在于，步骤一中所述初始寡核苷酸文库的序列如SEQIDNO.1所示，上游引物的序列如SEQIDNO.2所示，下游引物的序列如SEQIDNO.3所示。3.根据权利要求1所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸适配体筛选方法，其特征在于，步骤二中包被具体为：吸取100μLHN蛋白溶液包被于96孔ELISA微孔板中，4℃过夜；步骤三中的洗板具体为：甩去包被液，用300μLHEPEST洗涤微孔板三次，甩干，其中所述HEPEST为含0.05%Tween20的HEPES。4.根据权利要求1所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸适配体筛选方法，其特征在于，步骤四中所述封闭具体为：向微孔中加入200μL含3%BSA的HEPES液，37℃孵育2h。5.根据权利要求1所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸适配体筛选方法，其特征在于，步骤五中所述加核酸适配体文库具体为：甩去封闭液，用HEPEST洗涤三次...

【专利技术属性】
技术研发人员：王真，成杰，鲁琳，王家伟，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：北京;11