NK细胞的制备方法技术

本申请提供了NK细胞的制备方法，所述方法包括接种单个核细胞、第一次至第五扩增。利用所述方法，成本低，且所制备的NK细胞纯度高、扩增率高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种细胞的制备方法，更具体的，本专利技术涉及使用细胞因子扩增NK细胞的方法。
技术介绍
自然杀伤细胞(NK细胞)于30年前在外周血中被发现，CD3-CD56+淋巴细胞被定义为人NK细胞。NK细胞通常含有大量穿孔素(perforin)和颗粒酶B(granzymeB)，当激活的NK细胞遇到靶细胞时，NK细胞释放穿孔素和颗粒酶B攻击靶细胞。NK细胞还可以分泌IFN-γ、TNF-α、GM-CSF和IL-3等细胞因子，这些细胞因子可以直接作用于靶细胞，也可以通过激活其他种类的免疫细胞攻击靶细胞。肿瘤的生长是一个复杂的系统工程，涉及到肿瘤与肿瘤基质、血管生成因子和免疫系统中淋巴细胞等微环境之间的复杂交互作用。NK细胞是已知最有效的杀伤肿瘤细胞的免疫细胞之一，对抑制肿瘤组织的发生、发展和扩散起着重要的作用。有文献报道(KoepsellSA,MillerJS,McKennaDHJr.Naturalkillercells:areviewofmanufacturingandclinicalutility.Transfusion.2013Feb；53(2):404-10)，浸润到肿瘤组织中的NK细胞数量尽管非常少，但是NK细胞浸润到肿瘤组织的患者能明显的观察到其生存期的显著延长，及其肿瘤扩散比率的显著降低。与健康人的NK细胞相比，肿瘤患者NK细胞浸润到肿瘤组织中的杀伤能力显著降低。另外，肿瘤患者的NK细胞表面抑制受体如CD158a、CD158b和NKG2A表达显著上升，而激活受体如NKG2D、NKG2C、NPp30和CD69则显著下降。现有研究数据表明，癌症患者的NK细胞严重受损，这使得它们无法消灭肿瘤细胞。但这为肿瘤的免疫治疗提供了一个契机，即通过体外细胞活化和扩增的方法恢复或者重建NK细胞抗肿瘤的能力，提高NK细胞对肿瘤免疫治疗的效果。已经报道的许多临床前研究表明，NK细胞作为一种有效地免疫治疗方法可以用于治疗各种肿瘤。一些NK细胞临床研究的细胞制备方法已经有可能被转化成为临床级或者是cGMP级的标准制备过程(LaptevaN,DurettAG,etal.Large-scaleexvivoexpansionandcharacterizationofnaturalkillercellsforclinicalapplications.Cytotherapy.2012Oct；14(9):1131-43)。在这些报道的NK细胞制备方法中，大多使用外周血、脐血、骨髓中的单个核细胞作为培养NK细胞的样本。另外，还有文献报道(CampbellKS,HasegawaJ.Naturalkillercellbiology:anupdateandfuturedirections.JAllergyClinImmunol.2013Sep；132(3):536-44.)，体外扩增NK细胞，有多种因素都会影响到NK细胞的数量，从而降低NK细胞扩增的可能性。因此，需要有一种能够提高扩增数量和扩增纯度的NK细胞制备方法。
技术实现思路
本专利技术提供了由不同血液样本快速、高效、低成本地扩增NK细胞的方法。具体的，提供了一种制备NK细胞的方法，所述方法包括：接种单个核细胞、第一次扩增、第二次扩增、第三次扩增、第四次扩增和第五次扩增。在一些实施方式中，在接种单个核细胞的步骤之前，还包括从血液样品中分离单个核细胞的步骤。在一些实施方式中，在接种单个核细胞的步骤之前，还包括用人源化CD16和CD3单克隆抗体包被培养瓶的预处理步骤。培养瓶预处理本领域技术人员熟知利用单克隆抗体对培养瓶进行包被，以便于血液细胞生长的方法。在一些实施方式中，通过包含人源化CD16单抗和人源化CD3单抗的生理盐水在4℃温育培养瓶，例如温育过夜，实现培养瓶的预处理。在一些实施方式中，人源化CD16单抗的浓度为0-10ug/ml，人源化CD3单抗的浓度为0-10ug/ml。在一些实施方式中，人源化CD16单抗的浓度为2ug/ml、4ug/ml、5ug/ml或10ug/ml。在一些实施方式中，人源化CD3单抗的浓度为2ug/ml、4ug/ml、5ug/ml或10ug/ml。在一些实施方式中，人源化CD16单抗和人源化CD3单抗的浓度均为5ug/ml。分离单个核细胞从血液样品中分离单个核细胞的方法是本领域熟知的，如Ficoll分层液法、Percoll分层液法。在一些实施方式中，血液样品为外周血、脐血、骨髓。在一些实施方式中，通过Ficoll分层液法分离单个核细胞。在一些实施方式中，还包括将来自血液样品的血浆加热灭活，例如56℃灭活30min，获取自体的灭活血浆。在一些实施方式中，分离得到的单个核细胞中，NK[CD3-CD56+]比例为0.78％～11.71％，例如4.77％(外周血单个核细胞中)。接种单个核细胞将从血液样品中分离的单个核细胞以0.5×106个/ml至2×106个/ml的密度接种在包被细胞培养瓶中，进行培养。在一些实施方案中，所接种的单个核细胞的密度为0.5×106个/ml、0.6×106个/ml、0.7×106个/ml、0.8×106个/ml、0.9×106个/ml、1.0×106个/ml、1.2×106个/ml、1.5×106个/ml或2.0×106个/ml。在一些实施方式中，所述接种培养基含有2000至5000IU/mlIL-2、500至3000IU/mlIFN-γ、0-50ng/mlIL-7、0-50ng/mlIL-15和2-5％的自体灭活血浆或同血型的灭活血清。在一些实施方式中，IL-7的浓度可以为20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml或50ng/ml。在一些实施方式中，IL-15的浓度可以为20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml或50ng/ml。在一些实施方式中，IL-2的浓度为2000IU/ml、3000IU/ml、4000IU/ml或5000IU/ml。在一些实施方式中，IFN-γ的浓度是500IU/ml、1000IU/ml、2000IU/ml或3000IU/ml。在一些实施方式中，所述自体灭活血浆或同血型的灭活血清的浓度为2％、3％、4％或5％。在一个具体的实施方式中，接种培养基中含有4000IU/mlIL-2、2000IU/mlIFN-γ、30ng/mlIL-7、30ng/mlIL-15和5％的自体灭活血浆或同血型灭活血浆。本领域技术人员熟知适合来自血液的单个核细胞的培养条件，例如可以在37℃、CO2浓度为5％且湿度为45％-55％的培养箱中培养。第一次扩增在培养的第2天至第3天，向细胞中补加2倍体积的第一扩增培养基，进行第一次扩增。所述第一扩增培养基包含2-5％的自体灭活血浆或同血型灭活血浆、0-100ug/mlOK-432、0-50ng/mlIL-15和0-50ng/mlIL-12。在一些实施方式中，IL-12的浓度可以为20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml或50ng/ml。在一些实施方式中，IL-15的浓度可以为20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml或50ng/ml。在一些实施方式中，OK-43本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备NK细胞的方法，所述方法包括：1)接种单个核细胞，包括以0.5×106个/ml至2×106个/ml的密度将单个核细胞接种至含接种培养基的人源化CD16单抗和人源化CD3单抗包被的细胞培养瓶中，所述接种培养基含有2000至5000IU/ml IL‑2、500至3000IU/ml IFN‑γ、0‑50ng/ml IL‑7、0‑50ng/ml IL‑15和2‑5％的自体灭活血浆或同血型的灭活血清；2)第一次扩增，包括在培养的第2至第3天，向细胞中补加2倍体积的第一扩增培养基，其包含2‑5％的自体灭活血浆或同血型灭活血浆、0‑100ug/ml OK‑432、0‑50ng/ml IL‑15和0‑50ng/ml IL‑12；3)第二次扩增，包括在培养的第4至第5天，向细胞中补加7倍体积的第二扩增培养基，其包含2‑5％的自体灭活血浆或同血型灭活血浆、0‑100ug/ml OK‑432、0‑50ng/ml IL‑15和0‑50ng/ml IL‑12；4)第三次扩增，包括在培养的第7至第8天，向细胞中补加20倍体积的第三扩增培养基，其包含2‑5％的自体灭活血浆或同血型灭活血浆、500‑2000IU/ml IL‑2、0‑50ng/ml IL‑21和0‑50ng/ml IL‑18；5)第四次扩增，包括在培养的第9至10天，向细胞中补加30倍体积的第四扩增培养基，其包含500‑2000IU/ml IL‑2；6)第五次扩增，包括在培养的第12至14天，向细胞中补加20倍体积的第五扩增培养基，其包含500‑2000IU/ml IL‑2。...

【技术特征摘要】
1.一种制备NK细胞的方法，所述方法包括：1)接种单个核细胞，包括以0.5×106个/ml至2×106个/ml的密度将单个核细胞接种至含接种培养基的人源化CD16单抗和人源化CD3单抗包被的细胞培养瓶中，所述接种培养基含有2000至5000IU/mlIL-2、500至3000IU/mlIFN-γ、0-50ng/mlIL-7、0-50ng/mlIL-15和2-5％的自体灭活血浆或同血型的灭活血清；2)第一次扩增，包括在培养的第2至第3天，向细胞中补加2倍体积的第一扩增培养基，其包含2-5％的自体灭活血浆或同血型灭活血浆、0-100ug/mlOK-432、0-50ng/mlIL-15和0-50ng/mlIL-12；3)第二次扩增，包括在培养的第4至第5天，向细胞中补加7倍体积的第二扩增培养基，其包含2-5％的自体灭活血浆或同血型灭活血浆、0-100ug/mlOK-432、0-50ng/mlIL-15和0-50ng/mlIL-12；4)第三次扩增，包括在培养的第7至第8天，向细胞中补加20倍体积的第三扩增培养基，其包含2-5％的自体灭活血浆或同血型灭活血浆、500-2000IU/mlIL-2、0-50ng/mlIL-21和0-50ng/mlIL-18；5)第四次扩增，包括在培养的第9至10天，向细胞中补加30倍体积的第四扩增培养基，其包含500-2000IU/mlIL-2；6)第五次扩增，包括在培养的第12至14天，向细胞中补加20倍体积的第五扩增培养基，其包含500-2000I...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐榕，王立燕，
申请(专利权)人：北京同立海源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11