含有抗EGFR1抗体的缀合物制造技术

本发明专利技术涉及一种包含抗EGFR1抗体或其EGFR结合片段和至少一种葡聚糖衍生物的缀合物，其中葡聚糖衍生物包含至少一个D‑吡喃葡萄糖基单元，其中选自至少一个D‑吡喃葡萄糖基单元的碳2、3或4中的至少一个碳由下式的取代基取代‑O‑(CH2)n‑S‑B12H112‑,其中n处于3至10范围内；并且葡聚糖衍生物借助由至少一个醛基和抗EGFR1抗体或其EGFR1结合片段的氨基之间反应形成的键而与抗EGFR抗体或其EGFR1结合片段结合，所述至少一个醛基通过氧化性切割葡聚糖衍生物的D‑吡喃葡萄糖基单元而形成。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及治疗或调节人类中表达EGFR1的肿瘤细胞生长的缀合物(conjugate)、药物组合物和方法。专利技术背景硼中子捕获疗法(BNCT)是恶性肿瘤例如原发性脑肿瘤和头颈癌的一种非侵入性治疗形式。在BNCT中，向患者注射具有肿瘤定位能力并携带非放射性硼-10原子的药物。当药物用低能量热中子照射时，发出生物破坏性α粒子和锂-7原子核。BNCT需要具有高含量硼-10并且能够专门定位于肿瘤的药物，例如缀合物。这类缀合物应当易于生产、稳定、可溶解且安全。然而，提供这类缀合物是复杂的，例如原因在于一些类型的化学物质似乎与含有硼-10的化合物不兼容。本专利技术的目的是提供如与已知缀合物相比具有改善特性并含有高含量硼-10的缀合物。专利技术概述本专利技术的缀合物以权利要求1中所呈现的内容为表征。本专利技术的药物组合物以权利要求18中所呈现的内容为表征。用作药物的本专利技术缀合物或药物组合物以权利要求19中所呈现的内容为表征。用于治疗癌症的本专利技术缀合物或药物组合物以权利要求20中所呈现的内容为表征。治疗或调节人类中表达EGFR1的肿瘤细胞生长的方法以权利要求22中所呈现的内容为表征。本专利技术的原核宿主细胞以权利要求26中所呈现的内容为表征。治疗或调节人类中表达EGFR1的肿瘤细胞生长的方法以权利要求56中所呈现的内容为表征。本专利技术的多核苷酸以权利要求57、58、59和60中所呈现的内容为表征。附图简述纳入的附图旨在提供对本专利技术的进一步理解并且构成本说明书组成的一部分，该附图示例了本专利技术的实施例并且连同说明书一起有助于解释本专利技术原理。在附图中：图1.BSH-葡聚糖的质子-NMR谱。硼连接的质子在0.8-2.0ppm之间共振，并且通过比较硼-质子的积分与葡聚糖质子的积分，可以估计BSH-葡聚糖的硼载量。未反应的烯丙基在4.22、5.29、5.39和5.99ppm产生信号。在2.225ppm处的锐信号是丙酮(内标物)。图2.BSH-Dex-缀合物的凝胶过滤分析。A.抗EGFR1-Fab-BSH(800B)-Dex。用YarraSEC-3000凝胶过滤柱分析时，缀合物在7.8ml洗脱。相比之下，抗EGFR1-Fab在9.1ml洗脱。B.抗EGFR1-Fab2-BSH(800B)-Dex。用YarraSEC-3000凝胶过滤柱分析时，缀合物在6.9ml洗脱。相比之下，抗EGFR1-Fab2在8.4ml洗脱。图3.在非还原条件(小图A)和还原条件(小图B)下，硼量不同的荧光标记的抗EGFR1Fab/F(ab’)2硼缀合物的SDS-PAGE分析。抗EGFR1-Fab-BSH-Dex缀合物：泳道1(900B)、泳道2(700B)、泳道4(560B)、泳道6(360B)。抗EGFR1-F(ab’)2-BSH-Dex缀合物：泳道3(700B)、泳道5(560B)、泳道7(360B)。泳道8是抗EGFR1-Fab-Dex并且泳道9是含有抗EGFR1-F(ab’)2和Fc片段的混合物的对照(Fab片段在凝胶上的迁移类似于Fc片段)。采用考马斯蓝凝胶染色。图4.HSC-2细胞对荧光标记的抗EGFR1-F(ab’)2(小图A和C)和抗EGFR1-F(ab’)2-BSH(900B)-Dex(小图B和D)的细胞表面结合和内化。在+4℃(与细胞表面结合)和+37℃(与细胞表面结合并内化)进行了温育。通过荧光显微术实施了分析。图5.用于信号肽优化的载体结构例子。鉴定的T5启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号肽和抗EGFR1Fab重链序列和轻链序列。图6.针对Fab表达的启动子优化的结果。在液态LB培养基中用W3110pGF119(A)或BL21(DE3)pGF121(B)产生10ml表达培养物。将诱导后培养物在+20℃培育过夜，收获1ml样品并进行周质提取，随后蛋白质印迹检测。1)背景菌株w/o表达载体；2)W3110pGF119克隆#1；3)W3110pGF119克隆#2；4)W3110pGF119克隆#3；C)250ng对照Fab。图7.针对Fab表达的启动子优化的结果。用W3110pGF132在三个不同的诱导后温度产生10ml表达培养物：A)+20℃；B)+28℃和C)+37℃。使用不同的鼠李糖浓度用于诱导：1)rha0；2)rha0.25mM；3)rha1mM；4)rha4mM；5)rha8mM。C＝100ng对照fab。将诱导后培养物在所示温度培育4小时，收获1ml样品并且进行周质提取，随后蛋白质印迹检测。图8.比较双顺反子启动子与双重启动子结构。pGF119和pGF121是双顺反子载体，pGF120和pGF131是双重启动子载体。1)未诱导的对照；2)W3110pGF119#13)W3110pGF119#2；4)W3110pGF120未诱导；5)W3110pGF120#1；6)W3110pGF120#2；7)Lemo21(De3)pGF131#1；8)Lemo21(De3)pGF131#2；9)Lemo21(De3)pGF121#1；10)BL21(De3)pGF131#1；11)BL21(De3)pGF131#2；C)100ng对照fab。图9.含有周质伴侣SKP(pGF134)和SKP/FkpA(pGF135)的大肠杆菌(E.coli)Lemo21(De3)和BL21(DE3)中的抗EGFR1Fab表达。利用使得鼠李糖精细调节作用成为可能的菌株内置特征，产生Lemo21(De3)培养物。泳道1)Lemo21(De3)pGF131；2)Lemo21(De3)pGF131pGF134；3)Lemo21(De3)pGF131pGF135；4)BL21(De3)pGF131；5)BL21(De3)pGF131pGF134；6)BL21(De3)pGF131pGF135；C)对照Fab100ng。在+28℃利用250uM鼠李糖，与Lemo21(De3)pGF131(泳道1)相比，Lemo21(De3)pGF131pGF134和–pGF135(泳道2和3)产生的抗EGFR1Fab数量明显增加。在+20℃，与BL21(De3)pGF131(泳道4)相比，BL21(De3)pGF131pGF134和–pGF135(泳道5和6)产生的抗EGFR1Fab数量明显增加。图10.周质表达的抗EGFR1Fab的蛋白质印迹分析。泳道1)分子量标记；泳道2)抗EGFR1Fab对照蛋白，100ng；泳道3)空白；泳道4)诱导前细胞沉淀物样品；泳道5)诱导后4小时细胞沉淀物样品；泳道6)诱导后16小时细胞沉淀物样品；泳道7-9)空白；泳道10)诱导前培养上清液样品；泳道11)诱导后4小时培养上清液样品；泳道12)诱导后16小时培养上清液样品。全部样品均代表10μl发酵罐培养物悬液。比较诱导后16小时细胞沉淀物样品中的条带强度(泳道6)与泳道2(100ng)中对照抗EGR1Fab的条带强度，估计发酵罐培养的大肠杆菌细胞的周质提取物中的抗EGFR1Fab浓度。泳道6据估计含有300ng抗EGR1Fab：300ng/10μl＝30mg/L。图11.HiTrapSPFF纯化的周质提取物的色谱图。汇集级分A5-A10用于进一步纯化步骤。图12.蛋白质L纯化的样品的色本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种缀合物，其包含抗EGFR1抗体或其EGFR1结合片段和至少一种葡聚糖衍生物，其中所述葡聚糖衍生物包含至少一个D‑吡喃葡萄糖基单元，其中选自所述至少一个D‑吡喃葡萄糖基单元的碳2、3或4中的至少一个碳由下式的取代基取代‑O‑(CH2)n‑S‑B12H112‑其中n处于3至10的范围内；并且所述葡聚糖衍生物借助由至少一个醛基和所述抗EGFR1抗体或其EGFR1结合片段的氨基之间反应形成的键而与所述抗EGFR抗体或其EGFR1结合片段结合，所述至少一个醛基是通过所述葡聚糖衍生物的D‑吡喃葡萄糖基单元的氧化性切割而形成的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.13 FI 20145552;2015.02.20 FI 201551141.一种缀合物，其包含抗EGFR1抗体或其EGFR1结合片段和至少一种葡聚糖衍生物，其中所述葡聚糖衍生物包含至少一个D-吡喃葡萄糖基单元，其中选自所述至少一个D-吡喃葡萄糖基单元的碳2、3或4中的至少一个碳由下式的取代基取代-O-(CH2)n-S-B12H112-其中n处于3至10的范围内；并且所述葡聚糖衍生物借助由至少一个醛基和所述抗EGFR1抗体或其EGFR1结合片段的氨基之间反应形成的键而与所述抗EGFR抗体或其EGFR1结合片段结合，所述至少一个醛基是通过所述葡聚糖衍生物的D-吡喃葡萄糖基单元的氧化性切割而形成的。2.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述葡聚糖衍生物的分子质量处于约3至约2000kDa或约30至约300kDa范围内。3.根据权利要求1或2所述的缀合物，其中所述缀合物包含约10至约300个或约20至约150个式-O-(CH2)n-S-B12H112-的取代基。4.根据权利要求1–3中任一项所述的缀合物，其中所述抗EGFR1抗体或其EGFR1结合片段的氨基是所述抗EGFR1抗体或其EGFR1结合片段的赖氨酸残基的氨基。5.根据权利要求1–4中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物还包含与所述葡聚糖衍生物或与所述抗EGFR1抗体或其EGFR1结合片段结合的至少一个示踪分子。6.根据权利要求1–5中任一项所述的缀合物，其中所述葡聚糖衍生物包含由所述葡聚糖衍生物的D-吡喃葡萄糖基单元的氧化性切割所形成的封端的至少一个醛基。7.根据权利要求6所述的缀合物，其中所述葡聚糖衍生物包含由所述葡聚糖衍生物的D-吡喃葡萄糖基单元的氧化性切割所形成的多个醛基，并且由所述葡聚糖衍生物的一个或多个D-吡喃葡萄糖基单元氧化性切割形成的醛基基本上全部是封端的。8.根据权利要求1–7中任一项所述的缀合物，其通过包括以下步骤的方法可获得：a)链烯基化葡聚糖的至少一个羟基，以获得链烯基化的葡聚糖；b)硼卡钠(BSH)与从a)步骤可获得的链烯基化葡聚糖反应，以获得BSH-葡聚糖；c)氧化切割BSH-葡聚糖的至少一个D-吡喃葡萄糖基残基，从而形成醛基；d)从c)步骤可获得的氧化切割的BSH-葡聚糖与抗EGFR1抗体或其EGFR1结合片段反应，以获得缀合物。9.根据权利要求8所述的缀合物，其中使用链烯基化剂使葡聚糖在步骤a)中链烯基化，其中所述链烯基化剂具有下式的结构X-(CH2)mCH＝CH2其中m处于1至8的范围内，并且X是Br、Cl或I。10.根据权利要求8或9所述的缀合物，其中选自从a)步骤可获得的链烯基化葡聚糖的碳2、3或4中的至少一个碳由下式的取代基取代-O-(CH2)mCH＝CH2,其中m处于1至8的范围内。11.根据权利要求8-10中任一项所述的缀合物，其中BSH与从a)步骤可获得的链烯基化葡聚糖在选自过硫酸铵、过二硫酸钾和紫外线的自由基引发物存在下在步骤b)中反应。12.根据权利要求8-11中任一项所述的缀合物，其中将BSH-葡聚糖的所述至少一个D-吡喃葡萄糖基残基在步骤c)中使用选自高碘酸钠、高碘酸和乙酸铅(IV)的氧化剂氧化切割。13.根据权利要求8-12中任一项所述的缀合物，其中所述方法还包括步骤：从步骤c)可获得的氧化切割的BSH-葡聚糖或从步骤d)可获得的缀合物与示踪分子反应。14.根据权利要求8-13中任一项所述的缀合物，其中所述方法还包括步骤e)：将从步骤c)可获得的氧化切割的BSH-葡聚糖或从步骤d)可获得的缀合物的未反应的醛基封端。15.根据权利要求14所述的缀合物，其中所述未反应的醛基使用诸如乙醇胺、赖氨酸、甘氨酸或Tris的亲水封端剂封端。16.根据权利要求8-15中任一项所述的缀合物，其中所述葡聚糖的分子质量处于约3至约2000kDa、或约10至约100kDa、或约5至约200kDa、或约10至约250kDa的范围内。17.根据权利要求8-16中任一项所述的缀合物，其中通过将氧化切割的BSH-葡聚糖和所述抗EGFR1抗体或其EGFR1结合片段在步骤d)中在室温于具有约6至8pH的磷酸盐缓冲水溶液中温育，使氧化切割的BSH-葡聚糖与所述抗EGFR1抗体或其EGFR1结合片段反应。18.药物组合物，其包含权利要求1-17中任一项所述的缀合物。19.根据权利要求1-17中任一项所述的缀合物或根据权利要求18所述的药物组合物，用作药物。20.根据权利要求1-17中任一项所述的缀合物或根据权利要求18所述的药物组合物，用于治疗癌症。21.根据权利要求20所述用途的所述缀合物或药物组合物，其中所述癌症是头颈癌。22.治疗或调节人类中表达EGFR1的肿瘤细胞生长的方法，其中使权利要求1-17中任一项所述的缀合物或权利要求18所述的药物组合物以有效量施用至人类。23.根据权利要求22所述的方法，其中肿瘤内和/或静脉内施用所述缀合物或所述药物组合物。24.根据权利要求22或23所述的方法，其中在施用所述缀合物或所述药物组合物后分析肿瘤细胞中和血液中的硼浓度，并且肿瘤细胞中硼浓度对血液中硼浓度的比率高于1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、10:1、13:1、130:1或240:1。25.根据权利要求19所述的缀合物或药物组合物，其中所述药物通过硼中子捕获疗法用于头颈癌的肿瘤内和/或静脉内治疗。26.原核宿主细胞，其包含一个或多个多核苷酸，所述多核苷酸编码抗EGFR1抗体或其EGFR1结合片段的i)轻链可变区和ii)重链可变区。27.根据权利要求26所述的原核宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。28.根据权利要求26或27所述的原核宿主细胞，其中编码所述轻链可变区和重链可变区的所述一个或多个多核苷酸针对宿主细胞进行密码子优化。29.根据权利要求26-28中任一项所述的原核宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码所述抗EGFR1抗体或其EGFR1结合片段的轻链可变区和重链可变区的单个连续多核苷酸。30.根据权利要求26-29中任一项所述的原核宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码抗EGFR1抗体或其EGFR1结合片段的轻链可变区的多核苷酸和编码抗EGFR1抗体或其EGFR1结合片段的重链可变区的另一个多核苷酸。31.根据权利要求26-30中任一项所述的原核宿主细胞，其中所述轻链可变区和所述重链可变区之前有信号肽。32.根据权利要求31所述的原核宿主细胞，其中所述轻链可变区前的信号肽不同于所述重链可变区前的信号肽。33.根据权利要求31-32中任一项所述的原核宿主细胞，其中所述轻链可变区和所述重链可变区前的信号肽独立地选自gIII、malE、phoA、ompA、pelB、stII和stII。34.根据权利要求31-33中任一项所述的原核宿主细胞，其中所述轻链可变区和所述重链可变区前的信号肽独立地选自mpA、pelB、stII和stII。35.根据权利要求31-34中任一项所述的原核宿主细胞，其中所述轻链可变区前的信号肽与所述重链可变区前的信号肽相同，并且其中所述信号肽选自gIII、malE、phoA、ompA、pelB、stII和stII。36.根据权利要求31-35中任一项所述的原核宿主细胞，其中所述轻链可变区前的信号肽与所述重链可变区前的信号肽相同，并且其中所述信号肽选自ompA、pelB、stII和stII。37.根据权利要求31-36中任一项所述的原核宿主细胞，其中所述轻链可变区前有pelB信号肽并且所述重链可变区前有ompA信号肽。38.根据权利要求31-37中任一项所述的原核宿主细胞，其中所述轻链可变区和所述重链可变区前均有stII信号肽。39.根据权利要求26-38中任一项所述的原核宿主细胞，其中编码轻链可变区的多核苷酸包含在SEQIDNO:8或与SEQIDNO:8至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·勒帕宁，F·S·埃克赫姆，贾里·何琳，H·萨洛，A·卡内尔瓦，
申请(专利权)人：腾博龙公司，
类型：发明
国别省市：芬兰;FI