一种Ⅱ型糖尿病的基因诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种Ⅱ型糖尿病的基因诊断试剂盒，该试剂盒采用SEQ ID NO：1所示核苷酸序列作为特异检测因子,并分别采用SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列作为上游引物和下游引物。利用本发明专利技术的试剂盒能够对Ⅱ型糖尿病的易感性与易感人群进行基因诊断。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物
，尤其是一种在基因工程领域进行Ⅱ型糖尿病的诊断的试剂盒。
技术介绍
维生素D(VitaminD，VitD)生物学活性十分广泛，它对细胞的分化，中枢神经系统的功能和机体的细胞免疫和体液免疫反应有一定的调节作用，更参与体内的糖代谢。VitD结合蛋白(VitaminDbindingprotein,DBP)是一种由肝脏产生的α-球蛋白，是1,25-二羟VitD3的载体，对VitD生物学作用的发挥至关重要。所以DBP基因的变化可能会影响维生素D的数量和活性，进而影响胰岛素分泌、β-cell功能障碍和葡萄糖的代谢。本研究针对DBP基因与Ⅱ型糖尿病的生物学相关性进行了系列实验研究。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种Ⅱ型糖尿病的基因诊断试剂盒。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案如下。一种Ⅱ型糖尿病的基因诊断试剂盒，该试剂盒采用SEQIDNO：1所示核苷酸序列作为特异检测因子。作为本专利技术的一种优选技术方案，所述试剂盒分别采用SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示的核苷酸序列作为上游引物和下游引物。作为本专利技术的一种优选技术方案，所述试剂盒的聚合酶链式反应体系设置如下：PCR反应体系20μL，包括浓度为10μmol/L的上、下游引物各1.5μL，浓度为10-20ng/μL的DNA模板1μL，2xTaqPCRPlusMasterMix为反应体系的一半10μL，加入6μL去离子水使总的反应体系为20μL；PCR扩增反应条件：94℃条件下进行预变性5min，然后变性30s，温度为94℃，55℃退火45s，在72℃条件下延伸30s，总的循环数为34个，72℃条件下延伸8min，最后4℃保存。作为本专利技术的一种优选技术方案，所述试剂盒还包含有如下的酶切反应体系：酶切反应体系20μL，包括15μLPCR扩增产物，1μL10×loadingBuffer，0.5μL限制性内切酶，加入去离子水至20μL，置于37℃恒温仪1-16h；所用限制性内切酶为HaeⅢ,置于37℃过夜酶解消化。采用上述技术方案所产生的有益效果在于：我们的研究显示Ⅱ型糖尿病的发病与其基因型明确相关，因此能够利用本专利技术的试剂盒对Ⅱ型糖尿病的易感性与易感人群进行基因诊断。附图说明图1为rs7041位点基因分型电泳图谱；图中，M:marker；1、4、7:TG杂合；2、3:野生纯合TT；5、6:突变纯合GG。图2为DBP基因rs7041位点纯合基因型TT正向测序图谱。图3为DBP基因rs7041位点纯合基因型GG正向测序图谱。图4为DBP基因rs7041位点杂合基因型TG正向测序图谱。具体实施方式以下实施例详细说明了本专利技术。本专利技术所使用的各种试剂及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。实施例1、基因组DNA的提取采用百泰克公司(北京)提供的全血DNA提取试剂盒，具体操作步骤如下：(1)取解冻后EDTA-K2抗凝全血样品，颠倒混匀后取约2mL至10mL离心管中，向离心管中加入红细胞裂解液至9mL；(2)颠倒混匀后放入37℃恒温摇床中，10min后取出放入低温高速离心机中12000r/min，离心10min；(3)离心完成后，弃上清，再次加入红细胞裂解液至6mL，颠倒混匀后放入37℃恒温摇床中10min；(4)10min后，于低温高速离心机中12000r/min，离心10min，弃上清；(5)在涡旋振荡器上振荡打散细胞团，加入3mL细胞核裂解液，轻柔吹打混匀至液体有黏连性，放入55℃水浴锅中；(6)待液体变的清亮没有细胞团取出，冷却至室温，加入1.5mL蛋白沉淀液，涡旋振荡至出现蛋白沉淀和泡沫，12000r/min离心10min；(7)将上清液转移至新的10mL离心管中，转移过程中注意不要把泡沫和沉淀移出；(8)加入异丙醇(与移出液体等量)约4mL，颠倒混匀试管至出现絮状物，即DNA，12000r/min离心5min；(9)取出弃上清，加入3mL70％乙醇溶液清洗DNA，12000r/min离心5min，弃上清后，室温放置晾干；(10)加入200μLDNA溶解液，溶解混匀后，离心分装。实施例2、位点的选择及检测序列的筛查确定通过HapMap数据库获得中国人群和日本人群(CHB+JHB)DBP的SNPs信息，导入Haploview4.2软件中，设置为：定义连锁不平衡模块时采用95％可信区间，最小等位基因频率(MAF)＞0.05，重新判分后,运行Tagger(标签)工具，采用SNP之间r2＞0.8的标准选择标签SNP。最终，DBP基因选择了16个标签SNP。为进一步筛选SNP，从数据库中选择192对性别，年龄匹配的肥胖与体重正常对象，运用SequenomSNP分型检测技术对选择的16个易感基因多态性位点进行检测分型，采用logistic回归的方法分析16个SNP与肥胖遗传易感性之间的关系发现3个位点的变异与慢性病相关联。结合文献综述结果，拟对DBP基因rs7041位点进行研究。在Genbank中筛查rs7041位于第四号染色体的反义链71752617位置。实施例3、引物设计在PubMeddbSNP数据库下载DBP基因rs7041位点的序列，根据上下游引物序列长度、PCR产物长度、无发夹结构、无二聚体、无错配、合适的退火温度等选择并验证上下游引物，如下表所述。表1.DBP基因rs7041位点引物序列实施例4、溶液配制及仪器准备(1)50xTAE溶液的配制取Tris24.2g、EDTA3.72g于烧杯中加入乙酸5.71ml，加入适量超纯水，用玻璃棒搅拌至无色透明，定容至100ml(若配制250ml按比例相应增加各成分的量)。室温保存。(2)1xTAE溶液的配制取50xTAE溶液20ml于容量瓶中用超纯水定容至1000ml，上下颠倒混匀，保存于室温。(3)2％胶板的制作称取2g琼脂糖，量取100ml1xTAE，一起放入锥形瓶中溶解，之后于微波炉中加热至液体呈无色透明并冒出大泡，取出，冷却至50℃左右，加入10μLEB，倒入封好的板中，并插好梳子，凉至凝胶凝固，至少需要30分钟。凝胶完全凝固后拔出梳子，胶板即制作好。表2.主要试剂试剂名称生产厂家PCR扩增引物金唯智生物科技有限公司标准分子量600bpMarkerI上海莱枫生物科技有限公司2xTaqPCRPlusMasterMix上海莱枫生物科技有限公司MspI内切酶上海莱枫生物科技有限公司HaeⅢ内切酶上海莱枫生物科技有限公司琼脂糖上海莱枫生物科技有限公司Tris(三羟甲基氨基甲烷)上海化学试剂站异丙醇天津市科密欧化学试剂开发中心70％乙醇天津市恒兴化学试剂制造有限公司表3.主要仪器实施例5、PCR扩增反应体系设计实验过程中PCR的退火温度至关重要，根据梯度PCR选择最合适的温度作为退火温度。DBP基因rs7041位点的引物序列及PCR退火条件见表1，DNA模板序列如SEQIDNO：1所示。⑴、PCR反应体系，反应体系20μL，包括浓度为10μmol/L的上、下游引物各1.5μL，浓度为10-20ng/μL的DNA模板1μL，2xTaqPCRPlusMasterMix为反应体系的一半10μL，加入6μL去离子水使总的反应体系为20μL。⑵、DBP本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Ⅱ型糖尿病的基因诊断试剂盒，其特征在于：该试剂盒采用SEQ ID NO：1所示核苷酸序列作为特异检测因子。

【技术特征摘要】
1.一种Ⅱ型糖尿病的基因诊断试剂盒，其特征在于：该试剂盒采用SEQIDNO：1所示核苷酸序列作为特异检测因子。2.根据权利要求1所述的Ⅱ型糖尿病的基因诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒分别采用SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示的核苷酸序列作为上游引物和下游引物。3.根据权利要求1所述的Ⅱ型糖尿病的基因诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的聚合酶链式反应体系设置如下：PCR反应体系20μL，包括浓度为10μmol/L的上、下游引物各1.5μL，浓度为10-20ng/μL的DNA模板1μL，2xTaqPCRPlusMasterMix为反应体系的一半...

【专利技术属性】
技术研发人员：王重建，李玉倩，别荣海，毛振兴，玉崧成，王玲，刘晓田，蒋晶晶，张海庆，千新玲，张霞，周雯，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南;41