一种分离富集和测定农产品中的抗生素残留的方法技术

本发明专利技术涉及一种分离富集和测定农产品中的抗生素残留的方法，属于环境分析的技术领域；本发明专利技术首先通过预处理得到样品粗提液；然后在浮选池中加入含有抗生素标准液的盐溶液，再加L31定容；通氮气浮选，待浮选结束后，将浮选池静置至两相明显分离，记录上、下相的体积，把上相全部取出用于二次温度分离；待二次分离达到新的两相平衡后，记录上下相的体积；取上相进行分析；本发明专利技术将双水相体系与气浮溶剂浮选技术相耦合，既有效提高了温敏聚合物双水相体系的富集倍数，又避免传统气浮溶剂浮选使用苯、二甲苯等有机溶剂对环境造成二次污染，同时又将该技术与液相色谱‑串联质谱法联用，降低了农产品中抗生素的检测限。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种分离富集和测定农产品中的抗生素残留的方法，具体涉及一种温敏聚合物-盐双水相浮选分离与HPLC-MS/MS检测联用分析农产品中抗生素残留的方法，属于环境分析的

技术介绍
近年来盲目滥用抗生素的现象日益严重，长期或超标、滥用抗生素不但不能达到预期治疗疾病的目的，而且导致大量耐药性治病细菌的出现，造成农产品中抗生素残留日益严重。国家监督管理局公布的农产品的质量安全合格率抽检结果让我们对农产品中的抗生素残留情况表示严重担忧。在超市的动物内脏产品、生乳及养殖场动物尿样和饲料样中均检出氯霉素类、四环素类、磺胺类、硝基呋喃类代谢产物的报道,各种抗生素的检出率在3%-50%不等。抗生素类药物的不合理使用甚至滥用造成了农产品和环境中抗生素的残留严重，给生态环境和人类健康带来了严重威胁。抗生素残留问题已经引起社会的高度重视，人们对“绿色”生态农产品的需求也愈发强烈。因此，对农产品中抗生素残留的检测分析成为关注的热点。由于农产品的基质成分复杂，干扰多，且抗生素通常为痕量或超痕量存在，必须建立行之有效的方法对农产品中的抗生素残留进行分离/富集，从而达到分离干扰物质，降低检出限和提高测定准确度的目的。目前农产品中抗生素的传统前处理方法主要有：液-液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPEM)、超声波萃取技术(UAE)和加压溶剂萃取(PLE)等。然而这些方法存在着耗时、耗溶剂、重复性低等缺点，特别是前处理中使用的有机溶剂具有挥发性、可燃性和毒性等特点，以及随着国际社会对环境问题的日趋重视，有机溶剂的使用受到了不同程度的限制。与传统的前处理方法相比，温敏聚合物双水相浮选技术将双水相体系与气浮溶剂浮选技术相耦合，集二者的优势于一体，既有效提高了温敏聚合物双水相体系的富集倍数，又避免传统气浮溶剂浮选使用苯、二甲苯等有机溶剂对环境造成二次污染。在抗生素残留的分析检测方面，液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)兼具HPLC的强分离能力和MS的高灵敏度和极强的定性鉴定能力，是目前检测复杂基体组织中痕量抗生素发展最迅速的分析手段之一。基于此，将温敏聚合物双水相浮选前处理技术与HPLC-MS/MS联用，实现农产品中抗生素残留的超痕量检测与识别，具有重要的应用价值。基于此，本专利技术拟构建温敏聚合物循环双水相浮选分离/富集抗生素的新体系，并将该技术与液相色谱-串联质谱法联用，检测农产品中的抗生素残留。为农产品中抗生素的残留检测提供一种准确，高效，绿色，前景广阔的新型分析测试技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服目前抗生素分析前处理方法存在着耗时、耗溶剂、重复性低等缺点，特别是前处理中使用的有机溶剂具有挥发性、可燃性和毒性等特点，以及随着国际社会对环境问题的日趋重视，有机溶剂的使用受到了不同程度的限制，提供一种基于温敏聚合物双水相浮选分离富集农产品中的抗生素残留的方法，并将其与HPLC-MS/MS联用，降低抗生素检测的检出限以及提高测定准确度。为我国农产品中抗生素的残留检测提供一种准确，高效，绿色的新型分析检测技术。本专利技术采用的技术方案概述如下：一种分离富集和测定农产品中抗生素的方法，该方法包括以下步骤：（1）样品预处理：①猪肉样品：取代表性猪肉样品（应尽量避免取脂肪部分），用组织切碎机搅碎，均质处理。准确称取均质良好的样品2g（精确到0.01g）于15mL具塞离心管中，加入抗生素内标50μg/kg，再加入2mL磷酸缓冲溶液（50mmol/L）和8mL乙腈，涡旋2min，在低于10℃条件下2500×g离心10min。上层清液转移到另一干净的50mL具塞离心管中。将滤液保存在4℃冰箱内备用。②牛乳试样：准确取5mL牛乳样品于50mL具塞离心管中，称量和记录其质量。加入内标抗生素4μg/kg，再加入5mL磷酸缓冲溶液（50mmol/L）和30mL乙腈，涡旋2min，在低于10℃条件下2500×g离心10min。取20mL上清液到另一个干净的50mL具塞离心管中，注意不要混入析出的乳脂肪。将滤液保存在4℃冰箱内备用。（2）温敏聚合物双水相浮选抗生素：在50mL的浮选池中加入47.0mL已知浓度的含有抗生素标准液的盐溶液，调节体系pH；然后从浮选池顶部慢慢再加3.0mL一定浓度的（w/w）L31定容至刻度。打开氮气钢瓶，调节氮气流速，充分浮选后，关闭氮气，将浮选池静置至两相明显分离，记录上、下相的体积，上相主要包含L31和抗生素，把上相全部取出用于二次温度分离。将浮选后的上相取出加入一支新的10mL离心管，加入一定体积的蒸馏水，在室温下匀速的轻摇混合物5min，使其混合均匀，然后将离心管置于恒温为40℃水浴锅中(温度误差为±0.05K)，静置12h使其达到新的两相平衡，记录上下相的体积。下相为L31相，上相主要包含水和抗生素，取适量上相溶液进入HPLC-MS/MS进行分析。其中所述双水相浮选体系中的盐为K2HPO4、(NH4)2SO4、K2CO3、NaH2PO4、KCl和Na2SO4，其中所用盐最终为K2HPO4，其浓度范围为20～60%，优选为55%；所述温敏聚合物为L31，聚合物溶液中聚合物浓度为40%，60%和80%，优选为80%；所述pH范围为8.0～11.0，优选为11.0；所述浮选时间为10～60min，优选为50min；所述浮选流速为10～50mL·min-1，优选流速为30mL·min-1。所述浮选效果Y计算如下：式中Vt,Vb分别代表最后温度分离后的上下相体积，Ct,Cb分别代表最后温度分离后抗生素在上、下相的浓度。（3）在优化浮选体系中，将分离得到的上相溶液直接进入HPLC-MS/MS仪器进行分析测试，得到实验最终数据。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：（1）本专利技术首次构建温敏聚合物-盐双水相浮选体系分离富集农产品中的抗生素残留；首次将三嵌段聚合物L31-盐体系用于双水相分离富集农产品中的抗生素。与农产品中抗生素的传统前处理方法相比，温敏聚合物双水相浮选技术将双水相体系与气浮溶剂浮选技术相耦合，集二者的优势于一体，既有效提高了温敏聚合物双水相体系的富集倍数，又避免传统气浮溶剂浮选使用苯、二甲苯等有机溶剂对环境造成二次污染。实现了农产品中抗生素污染物的高效与绿色分离富集。（2）首次将温敏聚合物双水相浮选技术与HPLC-MS/MS相耦合，用于测定农产品中的抗生素残留，该技术达到降低检出限和提高测定准确度的目标，为农产品中抗生素的残留检测提供一种准确，高效，绿色，前景广阔的新型分析测试技术。实现了抗生素残留检测的检出限低于国家标准。（3）利用三嵌段聚合物L31的温敏特性，可加热高于其浊点时会与目标物分离，因此可以进入下一次的两相分离，将抗生素转移进入水相，利用HPLC-MS/MS的分析测定。具体实施方式下面的实施实例是为了使本领域的技术人员理解本专利技术，但不以任何方式限定本专利技术。在不背离本专利技术的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进替换或变型均属于本专利技术的保护范围。下面结合具体实例对本专利技术作进一步的说明。实施例1：（1）样品预处理：①猪肉样品：取代表性猪肉样品（应尽量避免取脂肪部分），用组织切碎机搅碎，均质处理。准确称取均质良好的样本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离富集和测定农产品中抗生素的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）样品预处理：将超市购买的猪肉样品和牛乳样品进行预处理，得到滤液保存在4℃冰箱内备用；（2）温敏聚合物双水相浮选抗生素：在浮选池中加入已知浓度的含有抗生素标准液的盐溶液，调节体系pH；然后从浮选池顶部慢慢再加一定浓度的温敏聚合物溶液定容至刻度；打开氮气钢瓶，调节氮气流速，充分浮选后，关闭氮气，将浮选池静置至两相明显分离，记录上、下相的体积，上相主要包含温敏聚合物和抗生素，把上相全部取出用于二次温度分离；将浮选后的上相取出加入一支新的离心管，加入一定体积的蒸馏水，在室温下匀速的轻摇混合物，使其混合均匀，然后将离心管置于恒温为水浴锅中，静置使其达到新的两相平衡，记录上下相的体积；下相为温敏聚合物相，上相主要包含水和抗生素，取适量上相溶液进入HPLC‑MS/MS进行分析；（3）在优化浮选体系中，将分离得到的上相溶液直接进入HPLC‑MS/MS仪器进行分析测试，得到实验最终数据。

【技术特征摘要】
1.一种分离富集和测定农产品中抗生素的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）样品预处理：将超市购买的猪肉样品和牛乳样品进行预处理，得到滤液保存在4℃冰箱内备用；（2）温敏聚合物双水相浮选抗生素：在浮选池中加入已知浓度的含有抗生素标准液的盐溶液，调节体系pH；然后从浮选池顶部慢慢再加一定浓度的温敏聚合物溶液定容至刻度；打开氮气钢瓶，调节氮气流速，充分浮选后，关闭氮气，将浮选池静置至两相明显分离，记录上、下相的体积，上相主要包含温敏聚合物和抗生素，把上相全部取出用于二次温度分离；将浮选后的上相取出加入一支新的离心管，加入一定体积的蒸馏水，在室温下匀速的轻摇混合物，使其混合均匀，然后将离心管置于恒温为水浴锅中，静置使其达到新的两相平衡，记录上下相的体积；下相为温敏聚合物相，上相主要包含水和抗生素，取适量上相溶液进入HPLC-MS/MS进行分析；（3）在优化浮选体系中，将分离得到的上相溶液直接进入HPLC-MS/MS仪器进行分析测试，得到实验最终数据。2.根据权利要求1所述的一种分离富集和测定农产品中抗生素的方法，其特征在于，步骤（2）中所述浮选池中加入的含有抗生素标准液的盐溶液与L31的体积比为47:3。3.根据权利要求1所述的一种分离富集和测定农产品中抗生素的方法，其特征在于，步骤（2）中所述双水相浮选体...

【专利技术属性】
技术研发人员：王婷婷，景张牧，张丹，刘向阳，高玲，曾正宏，韩娟，
申请(专利权)人：中华人民共和国盐城出入境检验检疫局，江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32