软骨细胞的无血清培养方法、及无血清培养基技术

【解决课题】本发明专利技术提供一种人软骨细胞的无血清培养方法、无血清培养基。【解决方案】本发明专利技术提供一种软骨细胞的无血清培养方法，包括：用蛋白分解酶处理含人软骨细胞的组织的酶处理工序；在酶处理工序之后，用前述蛋白分解酶的抑制剂处理前述组织的抑制剂处理工序；以及在抑制剂处理工序之后，用含有卡托吉宁Kartogenin或SAG中的任一者或两者、以及ITS、FGF2和氢化可的松的无血清培养基培养前述组织的培养工序。本发明专利技术提供一种用于培养软骨细胞的无血清培养基，含有卡托吉宁或SAG中的任一者或两者、以及ITS、FGF2和氢化可的松。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在进行无血清培养之前用蛋白分解酶处理细胞的软骨细胞的培养方法及适用于该方法的无血清培养基。
技术介绍
日本特开2003-125787号公报中，公开了软骨细胞分化培养中所使用的无血清培养基及使用了该无血清培养基的软骨细胞的培养方法。日本特许第3638614号公报中，公开了软骨细胞培养基和使用了该培养基的软骨细胞的培养方法。此外，该文献中公开了ITS。日本特表2002-529071号公报中，公开了用于软骨细胞样细胞的无血清培养基。日本特表2009-540826号公报中，公开了一种软骨细胞的培养方法，其为：从关节软骨活检中单独分离原代人软骨细胞，用蛋白酶(灰色链霉菌)进行1小时的酶消化，然后，用胶原酶进行酶消化。该文献中，为了从软骨剥离软骨细胞而使用胶原酶。若胶原酶过度作用，则对细胞造成损害。因此，如果在胶原酶附着于细胞的状态下进行无血清培养，则除了不能良好地培养软骨细胞以外，所得到的软骨细胞有时不能应用于移植等。日本特表2015-522590公报的段落[0145]中，记载了卡托吉宁即Kartogenin是一种有助于治疗骨关节炎的小分子。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2003-125787号公报专利文献2：日本特许第3638614号公报专利文献3：日本特表2002-529071号公报专利文献4：日本特表2009-540826号公报专利文献5：日本特表2015-522590公报
技术实现思路
专利技术要解决的问题上述培养方法中，虽然培养了软骨，但当实际要对培养的软骨进行移植等时，有时不能得到良好的结果。在此，本专利技术的目的在于提供一种能够有效地进行培养、此外还能够得到良好的移植结果的软骨细胞的无血清培养方法，能够用于该方法的无血清培养基。解决问题的方案本专利技术的第一方面涉及用于培养软骨细胞的无血清培养基。该培养基含有卡托吉宁或者SMO激动剂的SAG中的任一者或两者、以及ITS、FGF2和氢化可的松。优选地，该培养基含有卡托吉宁和SAG这两者。优选地，该培养基进一步含有IGF(胰岛素样生长因子)。优选地，该培养基进一步含有作为培养对象的软骨细胞。优选地，该培养基的优选利用方式为包括该培养基、以及抗坏血酸剂和脂肪酸剂的培养基试剂盒，抗坏血酸剂包括抗坏血酸、抗坏血酸的盐或抗坏血酸的溶剂化物，脂肪酸剂包括脂肪酸、脂肪酸的盐或脂肪酸的溶剂化物。本专利技术的第二方面涉及软骨细胞的无血清培养方法。该软骨细胞的无血清培养方法依次包括：用胶原酶处理含人软骨细胞的组织的酶处理工序；以及用无血清培养基培养组织的培养工序，无血清培养基含有卡托吉宁或SAG中的任一者或两者、以及ITS、FGF2和氢化可的松，其中，培养工序包括：在从培养开始第3天至第28天的期间内向无血清培养基中添加抗坏血酸、抗坏血酸的盐或抗坏血酸的溶剂化物，并且在从培养开始第3天至第28天的期间内向无血清培养基中添加脂肪酸、脂肪酸的盐或脂肪酸的溶剂化物。该方法优选进一步包括在酶处理工序之后，用胶原酶抑制剂处理组织的抑制剂处理工序。专利技术的效果提供一种能够有效地进行培养、此外还能够得到良好的移植结果的软骨细胞的无血清培养方法，能够用于该方法的无血清培养基。附图说明图1为表示实施例1中从培养第0天到第16天为止的培养软骨细胞的代替附图的照片。图2为表示实施例1中从培养第19天到第41天为止的培养软骨细胞的代替附图的照片。图3为表示比较例1中从培养第1天到第5天为止的培养软骨细胞的代替附图的照片。图4为表示实施例2(继代培养)中从培养第1天到第13天为止的培养软骨细胞的代替附图的照片。图5为表示实施例2中从培养第18天到第28天为止的培养软骨细胞的代替附图的照片。图6为表示实施例2中从培养第29天到第52天为止的培养软骨细胞的代替附图的照片。图7为表示比较例2中从培养第1天到第13天为止的培养软骨细胞的代替附图的照片。该例子中，除了使用不含SAG的DMEM培养基以外，与实施例2同样地操作，培养软骨。图8为表示将用无血清培养基培养的人耳廓软骨移植到裸鼠的背部，6个月后形成了软骨的样子的代替附图的照片。图9为表示将形成于裸鼠背部的软骨摘出而得到的标本的代替附图的照片。图10为表示将用无血清培养基(SAG+ITS)培养的人耳廓软骨移植到裸鼠背部、并将形成的软骨的切片用甲苯胺蓝、阿尔新蓝或弹性范吉松氏染色法EVG(ElasticaVangeson)染色而得到的结果的代替附图的照片。图11为表示将用无血清培养基(卡托吉宁Kartogenin+ITS)培养的人耳廓软骨移植到裸鼠背部、并将形成的软骨的切片用甲苯胺蓝、阿尔新蓝或EVG染色而得到的结果的代替附图的照片。图12为表示SAG浓度与培养软骨细胞的增殖之间的关系的曲线图。图13为表示在培养基中添加ITS和SAG的情况中，SAG浓度与培养软骨细胞的增殖之间的关系的曲线图。图14为表示在培养基中添加ITS和SAG的情况中，SAG浓度与培养软骨细胞的增殖之间的关系的另一曲线图。具体实施方式以下，使用附图对用于实施本专利技术的方式进行说明。本专利技术不限于以下说明的方式，还包括本领域技术人员基于以下的方式在显而易见的范围内适当修正而得到的方式。本专利技术涉及软骨细胞的无血清培养方法。该方法包括酶处理工序以及培养工序。该方法还可以包括抑制剂处理工序。酶处理工序是用蛋白分解酶处理含人软骨细胞的组织的工序。具体而言，是使含人软骨细胞的组织与蛋白分解酶接触，利用蛋白分解酶使含人软骨细胞的组织中所含的蛋白质分解的工序。由于用蛋白分解酶进行处理本身是已知的，因此基于已知的方法进行该工序即可。人软骨细胞的例子为从耳廓软骨、鼻中隔软骨、肋软骨、关节软骨、脊间软骨、气管软骨、喉头盖采集的软骨细胞、从人基因培养的人软骨细胞。采集人软骨细胞的方法是公知的。即，可以从外科患者采集人软骨细胞。另外，本专利技术可以适当使用能够分化为软骨细胞的细胞从而得到人软骨细胞。可以使用人、温血动物的来源于骨髓的细胞、来源于关节软骨的细胞、来源于皮肤的细胞、胚细胞、来源于胎儿的细胞，能够分化为软骨细胞的细胞的例子为人间充质干细胞、去分化而成的软骨细胞(例如去分化而成的人正常软骨细胞)。并且，本专利技术为了使人软骨组织和集合软骨细胞成为单细胞(singlecell)而用蛋白分解酶进行处理。该工序是将人软骨组织、集合细胞中所含的蛋白质的一部分用蛋白分解酶分解的消化工序。蛋白分解酶的例子为胰蛋白酶或胶原酶。胶原酶例如像日本特许第4764006号公报、日本特许第5322637号和日本特表2009-540826号公报中公开的那样，是公知的化合物。胶原酶优选为不含有来源于动物的成分的胶原酶。这样的胶原酶市面有售，因此购买不含有来源于动物的成分的胶原酶即可。该溶液中可以适当含有例如青霉素、链霉素那样的公知的抗生素。关于酶处理工序，例如准备含有蛋白分解酶的溶液，在该溶液中浸渍人软骨细胞即可。这样一来，能够将人软骨细胞中所含的蛋白质的一部分用蛋白分解酶分解。尤其优选地，胶原酶等蛋白分解酶与人软骨细胞作用至没有将人软骨细胞完全分解的程度。因此，溶液中优选含有0.01重量％以上1重量％以下(或0.1重量％以上0.5重量％以下)的蛋白分解酶。并且，浸渍时间优选调整为例如3小时以上24小时以下。抑制剂处理工序本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于培养软骨细胞的无血清培养基，其特征在于，含有：卡托吉宁Kartogenin或SAG中的任一者或两者、以及ITS、FGF2和氢化可的松。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.14 JP 2014-2314891.一种用于培养软骨细胞的无血清培养基，其特征在于，含有：卡托吉宁Kartogenin或SAG中的任一者或两者、以及ITS、FGF2和氢化可的松。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，含有卡托吉宁Kartogenin和SAG这两者的培养基。3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，进一步含有IGF即胰岛素样生长因子的培养基。4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，进一步含有作为培养对象的软骨细胞的培养基。5.一种培养基试剂盒，其为包括权利要求1所述的培养基、抗坏血酸剂和脂肪酸剂的培养基试剂盒，其特征在于，所述抗坏血酸剂包括抗坏血酸、抗坏血酸的盐或抗坏...

【专利技术属性】
技术研发人员：矢永博子，矢永克，
申请(专利权)人：再生医科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：日本;JP