用于诊断肺结核的方法技术

提供了诊断结核(TB)的方法。方法包括下述步骤：检测来自受试者的未受刺激的血液样品中的至少四种生物标志物的组，生物标志物选自补体C3、补体因子H、α‑2‑巨球蛋白、载脂蛋白(APO)‑A1、载脂蛋白APO‑CIII、载脂蛋白APO‑E、前白蛋白干扰素(IFN)‑γ、干扰素(IFN)‑α2、干扰素可诱导的蛋白质(IP)‑10、肿瘤坏死因子(TNF)‑α、表皮生长因子(EGF)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)‑1β、可溶性CD40配体(sCD40L)、转化生长因子(TGF)‑α、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素1受体拮抗物(IL‑1ra)、基质金属蛋白酶(MMP)‑2、基质金属蛋白酶(MMP)‑9、结合球蛋白、c‑反应蛋白(CRP)、血清淀粉样蛋白A(SAA)、原降钙素(PCT)、铁蛋白、组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)、纤维蛋白原和血清淀粉样蛋白A(SAA)。组可包括上面列举的大于四种生物标志物，比如上面列举的五种、六种、七种或甚至更多种生物标志物。也提供了实施该方法的装置。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求南非临时专利申请号2014/01456的优先权，其通过引用并入本文。
本专利技术涉及诊断受试者中结核的方法。
技术介绍
结核(TB)是主要的健康问题并且是发展中世界的一种最大的杀手，据估计每年有9百万新病例和150万人死亡(85％的病例出现在亚洲和非洲)。在最近这些年，在也感染了HIV的人中，结核病急剧增多。另外，疾病的抗药性菌株逐渐增多。控制TB的扩散严重受到疾病难以诊断和治疗的限制，十分缺乏处理该疾病的新工具。在发展中国家，用于诊断活动性TB的最广泛使用的测试依赖于在显微镜(涂片镜检)下检查患者的粘液。几乎在140年前开发的这种方法检测小于一半的所有活动性TB病例并且尤其很大程度上不能检测儿童、与HIV共同感染的疾病和具有抗药性形式的TB或其他的肺疾病的那些。分支杆菌结核(结核分枝杆菌)培养设施在资源受限地区中还未广泛地使用并且培养结果可能需要多达42天才能可用[5]。最近开发新的TB诊断方法的活动逐渐增多，但是这些仍需要实验室、稳定的电源和熟练员工递送结果，这在偏远和农村地区是难以实现的。高级TB免疫诊断测试，比如所谓的干扰素γ(IFN-γ)释放试验(IGRAs)，已经证实可用于诊断结核分枝杆菌感染[12-14]并且在高收入、低负担地区使用。但是，这些试验不能区分潜伏TB疾病和活动性TB并且所以不推荐在高负担地区使用[15]。已经尝试鉴定目前在IGRAs中使用的那些(ESAT-6/CFP-10/TB7.7)之外的新的抗原[16-18]，或响应目前在IGRAs中使用的抗原产生的新的宿主生物标志物[17,19-24]，但是这些研究仍在继续(参见[24])。研究人员已经研究了用结核分枝杆菌特异性抗原刺激血液细胞之后不同的细胞因子分泌方式[24]。这些大部分是基于流式细胞术和ELISPOT的方法并且已经表明，例如产生IFN-γ和IL-2的T细胞的频率和比例的列举可能具有潜能用于TB疾病的诊断[25-28]。但是，依赖于从全血分开分离的细胞的诊断方法是麻烦的并且需要实验室能力，而这在资源受限的地区通常不现实。先前已经显示，用结核分枝杆菌特异性抗原刺激之后全血样品中IFN-γ之外的宿主生物标志物的测量潜在地作为TB疾病的诊断形式[19,21,22,24]。但是，基于这些宿主生物标志物的测试(在Quantiferon上清液中检测的检测)需要过夜温育包含样品的Quantiferon管并且所以结果必须在从样品收集时的24小时后可用。对于基于刺激来自疑似患有新的结核分枝杆菌感染阶段依赖性抗原的TB疾病的个体的全血的方法，情况也是这样[16,20,30]。基于从全血分开外周血液单核细胞，用结核分枝杆菌特异性抗原刺激血液细胞和通过ELISPOT或流式细胞术评估产生细胞因子，尤其IFN-γ、TNF-α和IL-2的细胞的频率的诊断方法[25-28]已经显示出在诊断TB疾病中的潜能。但是，这些技术是麻烦的并且更适于研究实验室而不是常规的医院实验室，原因是需要高的技术水平，以分离细胞并且实施ELISPOT和流式细胞术。如果基于这些方法的试验继续显示出希望，这些测试将基于大量集中的和专业的实验室并且不容易在通常具有最高TB负担的资源受限的地区实现。相应的获得测试结果的较长时间，将使得疾病诊断延迟，延迟了启动患者治疗并且从而增加了疾病在患者接触者中传播的风险。XpertMTB/RIF测试(CepheidInc，CA，USA)是本领域的重要进展，其在2个小时内产生结果，并且结合利福平抗性的检测[6]。在成年人中，测试的合并灵敏度是67-98％并且特异性是约98％[7]。但是，比如较高成本、要求稳定的电源、集中化的实验室装置、训练的实验室工作人员和耗材的短货架期的限制等[8]，阻碍了测试资源受限地区和通常高负担地区中的广泛使用。因此，需要简单、精确和负担得起的TB测试，其可立即递送结果并且在资源受限的地区容易使用。
技术实现思路
根据本专利技术的第一实施方式，提供了诊断结核的方法，该方法包括下述步骤：检测来自怀疑患有结核的受试者的未受刺激的血液样品的至少四种、至少五种或至少六种生物标志物，其中生物标志物选自c-反应蛋白(CRP)、前白蛋白、干扰素(IFN)-γ、补体因子H、载脂蛋白(APO)-A1、干扰素可诱导的蛋白质(IP)-10、补体C3、α-2-巨球蛋白、APO-CIII、APO-E、干扰素(IFN)-α2、肿瘤坏死因子(TNF)-α、表皮生长因子(EGF)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1β、可溶性CD40配体(sCD40L)、转化生长因子(TGF)-α、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素1受体拮抗物(IL-1ra)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、基质金属蛋白酶(MMP)-9、结合球蛋白、血清淀粉样蛋白A(SAA)、原降钙素(PCT)、铁蛋白、组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)、纤维蛋白原和血清淀粉样蛋白A(SAA)。优选地，生物标志物选自CRP、前白蛋白、IFN-γ、补体因子H、载脂蛋白A1、IP-10、SAA、铁蛋白、纤维蛋白原、TGF-α、TPA、VEGF、PCT和TNF-α。至少两种、至少三种、至少四种或至少五种生物标志物可选自CRP、前白蛋白、IFN-γ、补体因子H、载脂蛋白A1和/或IP-10并且其他生物标志物可选自SAA、铁蛋白、纤维蛋白原、TGF-α、TPA、VEGF、PCT和/或TNF-α。更优选地，生物标志物可选自由CRP、前白蛋白、IFN-γ、补体因子H、载脂蛋白A1和IP-10组成的组，。甚至更优选地，该方法可包括检测样品的下述6种生物标志物：CRP、前白蛋白、IFN-γ、补体因子H、载脂蛋白A1和IP-10。捕获试剂可用于结合每种生物标志物。捕获试剂可以是抗体、亲合体、锚蛋白重复蛋白、犰狳重复蛋白、核酸适配体、修饰的核酸适配体、肽、修饰的肽、碳水化合物配体、合成配体或合成聚合物。一种或多种指示物可用于指示什么时候出现每种捕获试剂和生物标志物的结合。指示物可以是热量指示物、电化学指示物、发色指示物、光指示物、荧光指示物或放射性标记的指示物。可检测样品中生物标志物的水平以便确定受试者是否患有TB。例如，对于下述生物标志物，与样品中生物标志物的水平相当的测量信号高于相同生物标志物的阈值水平可以是结核疾病的指示物：IFN-α2、CRP、IFN-γ、IL-1ra、IP-10、TGF-α、TNF-α、VEGF、补体因子H、补体C3、PCT、SAA、铁蛋白、纤维蛋白原、TPA或MMP-9。另一方面，对于下述生物标志物，与样品中生物标志物的水平相当的测量信号低于相同生物标志物的阈值水平可以是结核疾病的指示物：APO-A1、APO-CIII、前白蛋白或MMP-2。阈值生物标志物的水平可相当于未患有结核的受试者中相同生物标志物的水平。血液样品可以是全血、血液血浆或血液血清，其来自已经离心的全血或来自允许凝结的血液。结核可以是肺结核。根据本专利技术的第二实施方式，提供了用于根据上述方法诊断结核的装置，该装置包括：用于从受试者接收血液样品的工具；用于结合至少四种上面列举的生物标志物的捕获试剂，前提是样品中存在生物标志物；和指示捕获试剂什么时候结合生物标志物的至少一种指示物。根据权利要求本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诊断结核的方法，所述方法包括下述步骤：检测来自疑似患有结核的受试者的未受刺激的血液样品的至少4种生物标志物，其中所述生物标志物选自由下述组成的组：c‑反应蛋白(CRP)、前白蛋白、干扰素(IFN)‑γ、补体因子H、载脂蛋白(APO)‑A1、干扰素可诱导的蛋白质(IP)‑10、补体C3、α‑2‑巨球蛋白、APO‑CIII、APO‑E、干扰素(IFN)‑α2、肿瘤坏死因子(TNF)‑α、表皮生长因子(EGF)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)‑1β、可溶性CD40配体(sCD40L)、转化生长因子(TGF)‑α、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素1受体拮抗物(IL‑1ra)、基质金属蛋白酶(MMP)‑2、基质金属蛋白酶(MMP)‑9、结合球蛋白、血清淀粉样蛋白A(SAA)、原降钙素(PCT)、铁蛋白、组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)、纤维蛋白原和血清淀粉样蛋白A(SAA)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.26 ZA 2014/014561.一种诊断结核的方法，所述方法包括下述步骤：检测来自疑似患有结核的受试者的未受刺激的血液样品的至少4种生物标志物，其中所述生物标志物选自由下述组成的组：c-反应蛋白(CRP)、前白蛋白、干扰素(IFN)-γ、补体因子H、载脂蛋白(APO)-A1、干扰素可诱导的蛋白质(IP)-10、补体C3、α-2-巨球蛋白、APO-CIII、APO-E、干扰素(IFN)-α2、肿瘤坏死因子(TNF)-α、表皮生长因子(EGF)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1β、可溶性CD40配体(sCD40L)、转化生长因子(TGF)-α、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素1受体拮抗物(IL-1ra)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、基质金属蛋白酶(MMP)-9、结合球蛋白、血清淀粉样蛋白A(SAA)、原降钙素(PCT)、铁蛋白、组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)、纤维蛋白原和血清淀粉样蛋白A(SAA)。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物标志物选自：CRP、前白蛋白、IFN-γ、补体因子H、载脂蛋白A1、IP-10、SAA、铁蛋白、纤维蛋白原、TGF-α、TPA、VEGF、PCT和TNF-α。3.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其包括检测所述样品的至少5种所述生物标志物。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其包括检测所述样品的至少6种所述生物标志物。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述生物标志物中的至少2种选自由CRP、前白蛋白、IFN-γ、补体因子H、载脂蛋白A1和IP-10组成的组，并且其他生物标志物选自由SAA、铁蛋白、纤维蛋白原、TGF-α、TPA、VEGF、PCT和TNF-α组成的组。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述生物标志物中的至少3种选自由CRP、前白蛋白、IFN-γ、补体因子H、载脂蛋白A1和IP-10组成的组，并且其他生物标志物选自由SAA、铁蛋白、纤维蛋白原、TGF-α、TPA、VEGF、PCT和TNF-α组成的组。7.根据权利要求3至6中任一项所述的方法，其中所述生物标志物中的至少4种选自由CRP、前白蛋白、IFN-γ、补体因子H、载脂蛋白A1和IP-10组成的组，并且其他生物标志物选自由SAA、铁蛋白、纤维蛋白原、TGF-α、TPA、VEGF、PCT和TNF-α组成的组。8.根据权利要求4至7中任一项所述的方法，其中所述生物标志物中的至少5种选自由CRP、前白蛋白、IFN-γ、补体因子H、载脂蛋白A1和IP-10组成的组，并且其他生物标志物选自由SAA、铁蛋白、纤维蛋白原、TGF-α、TPA、VEGF、PCT和TNF-α组成的组。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述生物标志物选自由CRP、前白蛋白、IFN-γ、补体因子H、载脂蛋白A1和IP-10组成的组。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其包括检测所述样品的下述6种生物标志物：CRP、前白蛋白、IFN-γ、补体因子H、载脂蛋白A1和I...

【专利技术属性】
技术研发人员：诺韦尔·尼韦皮·切古，格哈德·瓦尔茨尔，阿达内·米尔雷特，
申请(专利权)人：斯坦陵布什大学，
类型：发明
国别省市：南非;ZA