一种基于[email protected]纳米复合材料的电化学免疫传感器的制备方法及应用技术

技术编号:14707368 阅读:17 留言:0更新日期:2017-02-25 18:48
本发明专利技术属于纳米功能材料、免疫分析以及生物传感技术领域,提供了一种基于[email protected]纳米复合材料的电化学免疫传感器的制备方法及应用。采用[email protected]‑WO2.72/MWCNTs纳米复合材料作为检测抗体标记物,制备的夹心型电化学免疫传感器实现了对多种肿瘤标志物的灵敏检测,具有特异性强,灵敏度高和检出限低等优点,对肿瘤标志物CA724、CA242、CEA、PSA的检测具有重要的科学意义和临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于新型功能纳米材料、免疫分析和生物传感
,提供了一种基于[email protected]纳米复合材料的电化学免疫传感器的制备方法及应用
技术介绍
肿瘤的发病率高,不易察觉,我国病例数相当庞大,对人类的健康产生极大危害。肿瘤标志物是肿瘤细胞产生和释放的以抗原、酶、激素等形式的代谢产物存在于肿瘤细胞内或宿主体液中,其在临床上对于原发肿瘤的发现,肿瘤高危人群的筛选、良性和恶性肿瘤的鉴别诊断、肿瘤发展程度的判断,肿瘤的治疗效果的观察和评价及肿瘤复发和预后的预测产生极大的影响,引起人们的广泛关注。CA724、CA242、CEA、PSA等常见的肿瘤标志物,对于癌症的诊断都能起到一定的作用。夹心型电化学免疫传感器结合了高特异性的免疫分析技术和高灵敏的电化学分析技术,具有灵敏度高、制备简单、检测快速、成本低等优点,在临床检验、环境监测、食品安全控制、生物监测等领域都有重要的应用价值。氧化石墨烯表面有大量的羧基官能团,使得它更容易与有机物结合。且具有大的比表面积,良好的电子传递能力和催化性能,能有效固载抗体;金纳米粒子具有生物相容性好、导电性强的优点,可以结合大量的抗体,多余的金纳米粒子还可以增强电极的导电性。WO2.72/MWCNTs复合材料具有高的比表面积和导电率;将[email protected]合金杂化到WO2.72/MWCNTs上,大大提高了材料的热稳定性,导电性,催化性,生物相容性,可以明显的提高免疫传感器的灵敏度。
技术实现思路
本专利技术提供了一种基于[email protected]纳米复合材料的电化学免疫传感器的制备方法及应用,实现了对肿瘤标志物的超灵敏检测。本专利技术的目的之一是提供一种基于[email protected]纳米复合材料的电化学免疫传感器的制备方法。本专利技术的目的之二是将所制备的基于[email protected]纳米复合材料的电化学免疫传感器,用于检测肿瘤标志物。本专利技术的技术方案,包括以下步骤。一种基于[email protected]纳米复合材料的电化学免疫传感器的制备方法,步骤如下:(1)将直径为3~5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨,超纯水清洗干净;(2)取6µL、1.0~2.0mg/mL的金纳米粒子负载的氨基化石墨烯滴加到电极表面,室温下晾干,用超纯水冲洗电极表面,晾干;(3)继续将6µL、8.0~12.0µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面,超纯水冲洗,4℃冰箱中干燥;(4)继续将3µL、1.0~3.0mg/mL的牛血清蛋白BSA溶液滴加到电极表面,用以封闭电极表面上非特异性活性位点,超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中晾干;(5)继续滴加6µL、1fg/mL~10ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液到电极表面,超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中干燥;(6)将6µL、2.0~4.0mg/mL的[email protected]/MWCNTs-Ab2检测抗体孵化物溶液,滴涂于电极表面上,置于4℃冰箱中晾干,制得一种基于[email protected]纳米复合材料的电化学免疫传感器。所述金纳米粒子负载的氨基化石墨烯的制备,步骤如下:(1)金纳米粒子溶胶的制备将3.9~4.2mL、质量分数为1%的氯金酸HAuCl4和95mL超纯水加入250mL的三口烧瓶中,在油浴中加热至沸腾并回流,磁力搅拌下加入9~11mL、38.8mmol/L的柠檬酸钠溶液,持续搅拌并回流15~25min,至溶液变为酒红色并不再改变,将溶液室温下冷却,制得金纳米粒子的溶胶;(2)氨基化石墨烯的制备将90~120mg氧化石墨烯分散在40mL乙二醇中,超声30min,加入1mL的浓氨水,待悬浊液变为棕黑色后将其转移到聚四氟乙烯反应釜中,在180℃下反应10~15h;冷却至室温,用超纯水和乙醇各洗涤三次,放于60℃的干燥箱中干燥10h,制得氨基化石墨烯;(3)负载金纳米粒子的氨基化石墨烯的制备将8~12mg氨基化石墨烯加入到上述步骤(1)所制得的金纳米粒子溶胶中,搅拌3h,离心除去上清液,制得负载金纳米粒子的石墨烯。所述[email protected]/MWCNTs-Ab2检测抗体孵化物溶液的制备,步骤如下:(1)WO2.72/MWCNTs的合成将2~4g氯化钨WCl6分散在100mL的无水乙醇中,再加入0.8~1.6g的MWCNTs,将混合溶液加入聚四氟乙烯高压反应釜,密封,放入干燥箱中,160℃下反应24h,室温冷却,用乙醇和超纯水各洗涤三次,65℃~75℃的干燥箱中干燥10h,得WO2.72/MWCNTs固体;(2)[email protected]溶液的制备室温下,向100~120mL上述步骤2(1)中制得的金纳米粒子溶胶中,边搅拌边依次加入20~24mL、0.1mol/L的CTAB,2.2~2.6mL、0.1mol/L的抗坏血酸,50~60mL、0.01mol/L的AgNO3,以及5~6mL、0.25mol/L的NaOH溶液,持续搅拌20~30min,制得[email protected]溶液;(3)[email protected]/MWCNTs的合成将20~30mg上述步骤(1)制得的WO2.72/MWCNTs加入到上述步骤(2)所得[email protected]溶液中,搅拌下反应2h,用超纯水和乙醇分别洗涤三次,65℃~75℃干燥箱中干燥12h,得到[email protected]/MWCNTs;(3)[email protected]/MWCNTs-Ab2检测抗体孵化物溶液的制备将4~8mg的[email protected]/MWCNTs检测抗体标记物分散到1mLpH7.4磷酸盐缓冲溶液,加入1mL、20µg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液,4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12h,制得[email protected]/MWCNTs-Ab2检测抗体孵化物溶液,4℃下保存备用。一种基于[email protected]纳米复合材料的电化学免疫传感器,用于肿瘤标志物的检测,检测步骤如下:(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为辅助电极,所制备的传感器为工作电极,在10mL、50mmol/L的pH6.10~8.50磷酸盐缓冲溶液中进行测试;(2)用时间-电流法对分析物进行检测,输入电压为-0.4V,取样间隔0.1s,运行时间400s;(3)当背景电流趋于稳定后,每隔50s向10mL、50mmol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10µL、5mol/L的双氧水溶液,记录电流变化。上述所述肿瘤标志物选自下列之一:CA724、CA242、CEA、PSA。本专利技术所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。本专利技术的有益成果(1)本专利技术使用了金纳米粒子负载的氨基化石墨烯作为基底材料,石墨烯有大的比表面积,可提供更多金纳米粒子的结合位点,金纳米粒子的修饰提高了石墨烯的导电性,加快了电子的传递,同时可以固载大量的抗体,进而能够提高检测的灵敏度;(2)采用[email protected]/MWCNTs作为检测抗体标记物,MWCNTs可以分隔海胆状WO2.72,组织或减缓它们之间的堆积,增强复合材料的比表面积和导电率;Ag对过氧化氢有很强的催化作用,将[email protected]合金杂化到WO2.72/MWCNTs上,大大提高了材料的热稳定性,导电性,催化性,因此,[email protected]/MWCNTs作为二抗标记物实现了信号的多重放大,从而提高了传感器的灵敏度,降低了检测限;(3)一种[email protected]/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于[email protected]纳米复合材料的电化学免疫传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)将直径为3 ~ 5 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨,超纯水清洗干净;(2)取6 µL、1.0 ~ 2.0 mg/mL的金纳米粒子负载的氨基化石墨烯滴加到电极表面,室温下晾干,用超纯水冲洗电极表面,晾干;(3)继续将6 µL、8.0 ~ 12.0 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面,超纯水冲洗,4 ℃冰箱中干燥;(4)继续将3 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的牛血清蛋白BSA溶液滴加到电极表面,用以封闭电极表面上非特异性活性位点,超纯水冲洗电极表面,4 ℃冰箱中晾干;(5)继续滴加6 µL、1 fg/mL ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液到电极表面,超纯水冲洗电极表面,4 ℃冰箱中干燥;(6)将6 µL、2.0 ~ 4.0 mg/mL的[email protected]‑WO2.72/MWCNTs‑Ab2检测抗体孵化物溶液,滴涂于电极表面上,置于4 ℃冰箱中晾干,制得一种基于[email protected]纳米复合材料的电化学免疫传感器。

【技术特征摘要】
1.一种基于[email protected]纳米复合材料的电化学免疫传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)将直径为3~5mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨,超纯水清洗干净;(2)取6µL、1.0~2.0mg/mL的金纳米粒子负载的氨基化石墨烯滴加到电极表面,室温下晾干,用超纯水冲洗电极表面,晾干;(3)继续将6µL、8.0~12.0µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面,超纯水冲洗,4℃冰箱中干燥;(4)继续将3µL、1.0~3.0mg/mL的牛血清蛋白BSA溶液滴加到电极表面,用以封闭电极表面上非特异性活性位点,超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中晾干;(5)继续滴加6µL、1fg/mL~10ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液到电极表面,超纯水冲洗电极表面,4℃冰箱中干燥;(6)将6µL、2.0~4.0mg/mL的[email protected]/MWCNTs-Ab2检测抗体孵化物溶液,滴涂于电极表面上,置于4℃冰箱中晾干,制得一种基于[email protected]纳米复合材料的电化学免疫传感器。2.如权利要求1所述的一种基于[email protected]纳米复合材料的电化学免疫传感器的制备方法,所述金纳米粒子负载的氨基化石墨烯的制备,步骤如下:(1)金纳米粒子溶胶的制备将3.9~4.2mL、质量分数为1%的氯金酸HAuCl4和95mL超纯水加入250mL的三口烧瓶中,在油浴中加热至沸腾并回流,磁力搅拌下加入9~11mL、38.8mmol/L的柠檬酸钠溶液,持续搅拌并回流15~25min,至溶液变为酒红色并不再改变,将溶液室温下冷却,制得金纳米粒子的溶胶;(2)氨基化石墨烯的制备将90~120mg氧化石墨烯分散在40mL乙二醇中,超声30min,加入1mL的浓氨水,待悬浊液变为棕黑色后将其转移到聚四氟乙烯反应釜中,在180℃下反应10~15h;冷却至室温,用超纯水和乙醇各洗涤三次,放于60℃的干燥箱中干燥10h,制得氨基化石墨烯;(3)负载金纳米粒子的氨基化石墨烯的制备将8~12mg氨基化石墨烯加入到上述步骤(1)所制得的金纳米粒子溶胶中,搅拌3h,离心除去上清液,制得负载金纳米粒子的石墨烯。3.如权利要求1所述的一种基于[email protected]纳米复合材料的电化学免疫传感器的制备方法,所述[email protected]/MWCNTs-Ab2检测抗体孵化物溶液的制备,包括以下步骤:(1)WO2....

【专利技术属性】
技术研发人员:李月云韩健冯金慧王平刘青刘会董云会
申请(专利权)人:山东理工大学
类型:发明
国别省市:山东;37

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