中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒的制备方法技术

本发明专利技术涉及生化技术领域，公开了一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒的制备方法。该方法包含以下步骤：中空聚苯乙烯微球的活化、抗体的偶联、微球的封闭、洗涤、溶解。本发明专利技术中的实施方式中，通过在中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(简称：NGAL)试剂中使用中空聚苯乙烯微球，即通过在纳米SiO2内核上合成聚苯乙烯微球，再通过氢氟酸去除纳米SiO2内核，从而形成了中空的聚苯乙烯微球，降低了聚苯乙烯微球的密度，从而能够使微球更好的悬浮在溶液中，提高了试剂的稳定性，从而增强了检测试剂的检测灵敏度，有利于NGAL试剂的大批量稳定生产，具有重要的实际应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生化
，特别涉及一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒的制备方法。
技术介绍
人类中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin，NGAL)分子量约25kDa，共价结合于中性粒细胞明胶酶。NGAL生理状态下是一种生长因子，主要参与了早期肾脏上皮的发生、生长。在正常组织包括肾脏，肺，胃及结肠的上皮组织中表达量较低。肾脏缺血再灌注损伤后，近曲小管上皮大量表达NGAL，是近来发现的早期诊断AKI的敏感的生物学标志物。尿NGAL是肾脏缺血再灌注损伤的一个敏感的指标，同时其表达量与肾脏缺血时间相关。急性肾功能损伤过程中NGAL水平偏高，预后将发展成为急性肾功能衰竭。NGAL水平偏高通常出以下情况：心血管手术患者、病危人员、脓血性或出血性休克、肾移植、静脉X射线造影剂的反应和肾毒性治疗反映。50％以上的病人都会出现一定程度的急性肾功能衰竭，通常大病后期出现使得死亡率大大增加。目前在临床上使用的NGAL检测方法有酶免疫法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、乳胶增强透射免疫比浊法、普通透射比浊法等，但是ELISA和RIA检测法存在操作繁琐，标本需要预处理，检测时间长的缺点；普通透射比浊法存在灵敏度不够的缺点；而乳胶增强透射免疫比浊法通常存在试剂沉淀导致稳定性不好的缺点，从而导致检测灵敏度不够的问题。综上所述，提供一种试剂稳定性好的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒是我们目前亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒的制备方法，使得检测试剂的稳定性更好，从而增强了检测试剂的检测灵敏度。为解决上述技术问题，本专利技术的实施方式提供了一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒的制备方法，该制备方法包含以下步骤：中空聚苯乙烯微球的活化：向中空聚苯乙烯微球中加入第一缓冲液进行稀释后，加入N-羟基琥珀酰亚胺溶液，搅拌、混合均匀，在搅拌的过程中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，继续搅拌、洗涤后，溶解到第一缓冲液中，即得活化的中空聚苯乙烯微球溶液；抗体的偶联：向活化的中空聚苯乙烯微球溶液中加入中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体溶液，震荡反应后，即得第一混合液；微球的封闭：向第一混合液中加入牛血清白蛋白，震荡反应，即得第二混合液；洗涤、溶解：将第二混合液经过离心、超声洗涤后溶解到第二缓冲液中，即得中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒。本专利技术实施方式相对于现有技术而言，通过在中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)试剂中使用中空聚苯乙烯微球，即通过在纳米SiO2内核上合成聚苯乙烯微球，再通过氢氟酸去除纳米SiO2内核，从而形成了中空的聚苯乙烯微球，降低了聚苯乙烯微球的密度，从而能够使微球更好的悬浮在溶液中，提高了试剂的稳定性，从而增强了检测试剂的检测灵敏度。有利于中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)试剂的大批量稳定生产，具有重要的实际应用价值。另外，中空聚苯乙烯微球制备方法包含以下步骤：将硫酸锰和三氯化铁混合加入溶液中，搅拌均匀，加入氢氧化钠，调整温度反应1～2h得到铁酸锰；加入油酸，反应2～3h，得到油酸修饰的铁酸锰；取二氧化硅、十二烷基硫酸钠、苯乙烯、过硫酸钾溶于去离子水中，搅拌均匀；加入油酸修饰的铁酸锰，调整温度，反应1～3h后加入丙稀酸，继续搅拌3～7h；然后加入氢氟酸，维持搅拌1～3h，即得中空聚苯乙烯微球，通过在纳米SiO2内核上合成聚苯乙烯微球，再通过氢氟酸去除纳米SiO2内核，从而形成了中空的聚苯乙烯微球，降低了聚苯乙烯微球的密度，从而能够使微球更好的悬浮在溶液中。另外，中空聚苯乙烯微球制备方法包含以下步骤：将硫酸锰和三氯化铁混合加入溶液中，搅拌均匀，加入氢氧化钠，调整温度反应1～2h得到铁酸锰；加入油酸，反应2～3h，得到油酸修饰的铁酸锰；取二氧化硅、十二烷基硫酸钠、苯乙烯、过硫酸钾溶于去离子水中，搅拌均匀；加入油酸修饰的铁酸锰，调整温度，加入氢氟酸，维持搅拌1～3h，再加入丙稀酸，继续搅拌3～7h；即得中空聚苯乙烯微球，通过在纳米SiO2内核上合成聚苯乙烯微球，再通过氢氟酸去除纳米SiO2内核，从而形成了中空的聚苯乙烯微球，降低了聚苯乙烯微球的密度，从而能够使微球更好的悬浮在溶液中。另外，二氧化硅的质量浓度为0.25～0.1g/ml，二氧化硅的粒径为30～80nm。这样可以使最终形成的空心微球的直径在30～80nm，中空聚苯乙烯微球的密度在1.01～1.03g/cm3，从而能够保证微球能够更好的悬浮在水中，提高了试剂的稳定性。另外，十二烷基硫酸钠的质量浓度为1～20mg/ml。这样使得合成的聚苯乙烯层厚度在30～100nm内，从而保证试剂能够满足产品技术要求中线性和灵敏度的指标。另外，苯乙烯与去离子水的体积比为1:5。这样可以保证苯乙烯的利用率最高，使95％以上的苯乙烯转化为聚苯乙烯。另外，中空聚苯乙烯微球包括空心聚苯乙烯微球、铁锰层以及油酸层，铁锰层通过油酸层将铁锰层均匀的包被在空心聚苯乙烯微球的外侧，其中，空心聚苯乙烯微球的空心部分直径为30nm～80nm，空心聚苯乙烯微球形成的聚苯乙烯层的厚度为30nm～100nm，铁锰层的厚度为20nm～50nm，油酸层的厚度为2nm～10nm，通过合成出由油酸修饰的铁酸锰包覆的中空聚苯乙烯微球，铁酸锰不仅具备与四氧化三铁一样很高的超顺磁性、便于分离的优点，而且具有成本更低，所合成的包覆外层能够更好的控制形貌和尺寸的优点；并且所合成的磁性中空聚苯乙烯微球能够更好的控制尺寸，使得中空聚苯乙烯微球更适用于体外诊断试剂中。另外，第一缓冲液为2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，第一缓冲液的浓度为25～100mM，pH为5.5～6.5。这是第一缓冲液优选的最佳离子强度和pH，使得抗体能够更多的包覆到中空聚苯乙烯微球上，从而达到较高的检测效果。另外，N-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度为10～200mg/mL；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液的浓度为5～80mg/mL。这样能够更好的活化微球，提高抗体交联到中空聚苯乙烯微球上的效率。另外，第二缓冲溶液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸，第二缓冲溶液的浓度为25～100mM。使缓冲溶液具有合适的pH，使得中空聚苯乙烯微球能够稳定地溶解在缓冲液中。附图说明图1是根据本专利技术第一实施方式中的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒的制备流程图；图2是根据本专利技术第五实施方式中的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒的线性偏差检测曲线。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本专利技术各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。本专利技术的第一实施方式涉及一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒的制备方法，该制备方法包含以下步骤：中空聚苯乙烯微球的活化：向中空聚苯乙烯微球中加入第一缓冲液进行稀释后，加入N-羟本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：中空聚苯乙烯微球的活化：向中空聚苯乙烯微球中加入第一缓冲液进行稀释后，加入N‑羟基琥珀酰亚胺溶液，搅拌、混合均匀，在所述搅拌的过程中加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，继续搅拌、洗涤后，溶解到所述第一缓冲液中，即得活化的中空聚苯乙烯微球溶液；抗体的偶联：向所述活化的中空聚苯乙烯微球溶液中加入中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体溶液，震荡反应后，即得第一混合液；微球的封闭：向所述第一混合液中加入牛血清白蛋白，震荡反应，即得第二混合液；洗涤、溶解：将所述第二混合液经过离心、超声洗涤后溶解到第二缓冲液中，即得中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒。

【技术特征摘要】
1.一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：中空聚苯乙烯微球的活化：向中空聚苯乙烯微球中加入第一缓冲液进行稀释后，加入N-羟基琥珀酰亚胺溶液，搅拌、混合均匀，在所述搅拌的过程中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，继续搅拌、洗涤后，溶解到所述第一缓冲液中，即得活化的中空聚苯乙烯微球溶液；抗体的偶联：向所述活化的中空聚苯乙烯微球溶液中加入中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体溶液，震荡反应后，即得第一混合液；微球的封闭：向所述第一混合液中加入牛血清白蛋白，震荡反应，即得第二混合液；洗涤、溶解：将所述第二混合液经过离心、超声洗涤后溶解到第二缓冲液中，即得中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述中空聚苯乙烯微球制备方法包含以下步骤：将硫酸锰和三氯化铁混合加入溶液中，搅拌均匀，加入氢氧化钠，调整温度反应1～2h得到铁酸锰；加入油酸，反应2～3h，得到油酸修饰的铁酸锰；取二氧化硅、十二烷基硫酸钠、苯乙烯、过硫酸钾溶于去离子水中，搅拌均匀；加入所述油酸修饰的铁酸锰，调整温度，反应1～3h后加入丙稀酸，继续搅拌3～7h；然后加入氢氟酸，维持搅拌1～3h，即得中空聚苯乙烯微球。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述中空聚苯乙烯微球制备方法包含以下步骤：将硫酸锰和三氯化铁混合加入溶液中，搅拌均匀，加入氢氧化钠，调整温度反应1～2h得到铁酸锰；加入油酸，反应2～3h，得到油酸修饰的铁酸锰；取二氧化硅、十二烷基硫酸钠、苯乙烯...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛精诚，李小小，沈宇杰，陈汉艳，
申请(专利权)人：上海科华生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31