基于苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8-OhdG活性的方法技术

本发明专利技术公开基于苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8‑OhdG活性的方法，包括以下步骤：带有巯基的DNA四面体结构的制备；带有巯基的DNA四面体结构在金电极上的修饰得到顶端连接8‑OHdG适体的巯基的DNA四面体结构的电极；G‑四链体电极的形成；聚苯胺沉积的电化学传感电极；利用电化学方法对产生的聚苯胺的电流信号进行检测从而检测8‑OhdG的活性。本发明专利技术极大地提高了8‑OHdG的检测灵敏度。与传统的以8‑OHdG还原峰为信号的电化学检测方法相比，检测限降低2个数量级。本发明专利技术无需制备复杂材料以及标记DNA探针，可避免材料制备及标记DNA探针而导致检测成本高、操作烦琐，重现性差的缺陷。本发明专利技术具有成本低、快速、简便、灵敏度高的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于定量检测8-羟基脱氧鸟苷活性的生物传感技术，具体涉及基于苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8-OhdG活性的方法。
技术介绍
氧化应激带来的氧化损伤是引起人类的各种疾病和伤害的一个重要因素。8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG)是活性氧自由基(ROS)引起DNA氧化损伤修饰产物之一，其生成原因很多，主要是电离辐射、化学致癌物代谢活化及细胞正常新陈代谢过程产生大量ROS直接攻击DNA中的鸟嘌呤(dG),使脱氧鸟苷氧化为8-OHdG。8-OHdG可被机体特异性DNA修复酶剪切清除并经肾脏随尿排泄,其含量反映机体氧化损伤程度,既是个体接触标志物,又是效应标志物。它一旦逃避了机体自身修复,就可能成为致突变、致畸、致癌的启动因子。8-OHdG在体内稳定存在，为代谢终产物,且只能通过DNA氧化损伤途径形成,并可通过分析其在组织细胞核DNA及线粒体DNA中的含量来反映体内DNA氧化损伤，体液中8-OHdG水平不受饮食等因素影响,不是细胞更新结果,是目前国际上公认的一种新型评价DNA氧化损伤和氧化应激状态的敏感指标和生物标志物。因此测定机体8-OHdG含量对评估体内氧化损伤和修复程度,氧化应激与DNA损伤相互关系,研究退行性疾病、衰老机制、癌发生机制、环境毒物、慢性炎症疾病与氧化应激的关系等均有重要的意义,也可以用来评价抗氧化剂治疗DNA氧化损伤的效果。传统的8-OHdG检测方法主要有高效液相色谱-电化学法(HPLC-ECD)、酶联免疫吸附法(ELISA)、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)、高效毛细管电泳(HPCE)。高效液相色谱-电化学法需样品量小，无损伤性，速度快，选择性好，对组织细胞DNA及尿中8-OHdG均可检测,是目前应用广泛、较为成熟的方法。但由于仪器价格较高,此法并未推广应用于常规检验。传统的电化学检测8-OHdG的信号来源是其本身的还原峰，灵敏度不够高。酶联免疫吸附法应用单克隆抗体检测加合物的技术，灵敏度高、重复性好,可用于分析生物样品,尤其是尿中DNA和RNA的氧化损伤产物。然而此法存在交叉反应，可能导致检测值比真实值偏高。因此，对8-OHdG分析的简单、灵敏、低成本的原位实时监测仍然是当前亟待解决的问题。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供了基于苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8-OhdG活性的方法，即基于聚苯胺沉积和DNA纳米结构电化学传感进行定量测定8-OHdG的方法。本专利技术中针对8-OHdG作用于8-OHdG适体产生G-四链体而形成的辣根过氧化物模拟酶，从而催化苯胺到聚苯胺的特异性氧化反应，测得聚苯胺的电化学响应信号。DNA正四面体及8-OHdG引发的G-四链体均含有丰富的DNA双链，而这些DNA双链因其表面丰富的负电荷而成为优秀的苯胺聚合模板，极大地提高了8-OHdG的检测灵敏度。与传统的以8-OHdG还原峰为信号的电化学检测方法相比，检测限降低2个数量级。此外，该方法还具有准确性好、无标记、简单易行等优点。技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案为：基于苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8-OhdG活性的方法，包括以下步骤：1)带有巯基的DNA四面体结构的制备；2)带有巯基的DNA四面体结构在金电极上的修饰得到顶端连接8-OHdG适体的巯基的DNA四面体结构的电极；3)顶端连接8-OHdG适体的巯基的DNA四面体结构的电极中加入8-OHdG和辅助因子氯化血红素的条件下8-OHdG适体的空间构型发生变化，形成G-四链体电极；4)G-四链体电极中加入过氧化氢和苯胺的CH3COOH-CH3COONa缓冲溶液，电极表面形成具有过氧化酶催化活性的G-四链体DNA辣根过氧化物模拟酶，辣根过氧化物模拟酶催化苯胺形成聚苯胺得到聚苯胺沉积的电化学传感电极；5)利用电化学方法对产生的聚苯胺的电流信号进行检测从而检测8-OhdG的活性。其中，上述步骤1)的具体步骤如下：将5’端修饰了巯基的A、B、C三条单链和5’端接了8-羟基脱氧鸟苷适体的D链各0.5～2μL等比例混合在40～50μLTM缓冲液和0.5～2μLTCEP中，配成终浓度为0.5～2μM的样品，然后将配好的样品放入90～100℃热水浴中持续3～10min，然后迅速降温到1～5℃，并在1～5℃中持续20～40分钟以上，即可得到带有巯基的DNA四面体结构。其中，上述步骤2)的具体步骤如下：将四面体DNA纳米结构滴加到清洗干净的电极表面，盖上烧杯，常温过夜组装即得。其中，上述步骤3)的具体步骤如下：PBS缓冲液冲洗步骤3)得到的电极的表面，除去非特异性结合，在电极表面滴加浓度不同的8-羟基脱氧鸟苷，室温反应1小时，PBS冲洗，滴加氯化血红素溶液，室温反应1小时，即得G-四链体结构的电极。其中，上述步骤3)的8-OHdG在缓冲液中的终浓度为0～5nM；优选地0.05～0.5nm。其中，上述步骤3)中的氯化血红素溶液的浓度为0～20μM。其中，上述步骤4)中苯胺和过氧化氢的浓度均为80～120mM。苯胺和过氧化氢在HAc-NaAc缓冲溶液(pH＝4.3)里混合，将组装好的电极浸泡到里面，室温反应。其中，上述步骤1)中TM缓冲溶液为含有pH＝8.0的20mMTris-HCl溶液和50mMMgCl2溶液，所述CH3COOH-CH3COONa缓冲溶液为含有100mMCH3COOH和100mMCH3COONa的pH＝4.3的缓冲溶液。其中，上述步骤4)的反应时间为60～120min，更为优选地，所述反应时间为90min。其中，上述步骤5)的具体步骤如下：将步骤4)修饰好的电极作为工作电极，用一个铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，形成三电极体系，缓冲溶液中执行参数的设置如下：电压范围-0.5V到0V；电位增量：0.004V；脉冲宽度：0.05s；采样宽度：0.0167s；脉冲周期：0.2s；静置时间：2s。本专利技术提供的基于聚苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8-OHdG活性的方法的原理为：本专利技术通过在金电极上修饰了带有巯基和8-OHdG的DNA纳米结构，利用8-OHdG适体与8-OHdG之间的作用，在hemin的存在下形成辣根过氧化物模拟酶G-四链体。在过氧化氢的存在下，DNA四面体和G-四链体结构上会发生辣根过氧化物模拟酶催化苯胺到聚苯胺的特异性氧化反应，聚苯胺的还原得到很强的电化学响应信号。上述方法中，DNA纳米结构是通过巯基与金电极之间的Au-S键从而修饰在电极上。上述方法中，聚苯胺的还原机理具体如下：有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下的特色及优点：(1)本专利技术利用DNA四面体构型的稳定性和刚性保证了适体的取向、适体间的距离，避免适体互相缠绕。(2)Hemin-G四链体接在DNA四面体上时会增强该过氧化物模拟酶的催化活性。(3)本专利技术利用8-OHdG对其8-OHdG适体的特异性识别来提高其特异性。(4)本专利技术在实验过程中，借助聚苯胺(PANI)卓越氧化还原特性及良好的环境稳定性，在过氧化氢存在下，辣根过氧化物酶有效催化氧化苯胺产生聚苯胺，此反应具有更高的动力学可控性和高效酶催化活性等优点。(5)电化学生物传感器具有高灵敏度、高兼容性和成本低廉本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8‑OhdG活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)带有巯基的DNA四面体结构的制备；2)带有巯基的DNA四面体结构在金电极上的修饰得到顶端连接8‑OHdG适体的巯基的DNA四面体结构的电极；3)顶端连接8‑OHdG适体的巯基的DNA四面体结构的电极中加入8‑OHdG和辅助因子氯化血红素的条件下8‑OHdG适体的空间构型发生变化，形成具有G‑四链体结构的电极，G‑四链体结构具有辣根过氧化物模拟酶性质；4)G‑四链体电极中加入过氧化氢和苯胺的CH3COOH‑CH3COONa缓冲溶液，G‑四链体作为辣根过氧化物模拟酶催化苯胺形成聚苯胺得到聚苯胺沉积的电化学传感电极；5)利用电化学方法对产生的聚苯胺的电流信号进行检测从而检测8‑OhdG的活性。

【技术特征摘要】
1.基于苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8-OhdG活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)带有巯基的DNA四面体结构的制备；2)带有巯基的DNA四面体结构在金电极上的修饰得到顶端连接8-OHdG适体的巯基的DNA四面体结构的电极；3)顶端连接8-OHdG适体的巯基的DNA四面体结构的电极中加入8-OHdG和辅助因子氯化血红素的条件下8-OHdG适体的空间构型发生变化，形成具有G-四链体结构的电极，G-四链体结构具有辣根过氧化物模拟酶性质；4)G-四链体电极中加入过氧化氢和苯胺的CH3COOH-CH3COONa缓冲溶液，G-四链体作为辣根过氧化物模拟酶催化苯胺形成聚苯胺得到聚苯胺沉积的电化学传感电极；5)利用电化学方法对产生的聚苯胺的电流信号进行检测从而检测8-OhdG的活性。2.根据权利要求1所述的基于苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8-OhdG活性的方法，其特征在于，所述步骤1)的具体步骤如下：将5’端修饰了巯基的A、B、C三条单链和5’端接了8-羟基脱氧鸟苷适体的D链各0.5～2μL等比例混合在40～50μLTM缓冲液和0.5～2μLTCEP中，配成终浓度为0.5～2μM的样品，然后将配好的样品放入90～100℃热水浴中持续3～10min，然后迅速降温到1～5℃，并在1～5℃中持续20～40分钟以上，即可得到带有巯基的DNA四面体结构。3.根据权利要求1所述的基于苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8-OhdG活性的方法，其特征在于，所述步骤2)的具体步骤如下：将带有巯基的DNA四面体结构滴加到清洗干净的电极表面，盖上烧杯，常温过夜组装即得。4.根据权利要求1所述的基于苯胺沉积的电化学传感电...

【专利技术属性】
技术研发人员：卫伟，范佳慧，张雪红，徐晓林，陈昌慧，刘松琴，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32