用于肺癌的循环肿瘤细胞诊断制造技术

本发明专利技术提供了用于诊断受试者中肺癌的方法，包括：(a)基于直接分析从获自受试者的血液样品中产生循环肿瘤细胞(CTC)数据，所述直接分析包括所述样品中有核细胞的免疫荧光染色和形态特征，其中基于所述免疫荧光染色和形态特征的组合在周围的有核细胞的背景中鉴别CTC；(b)获得所述受试者的临床数据；(c)将所述CTC数据与所述临床数据组合以诊断所述受试者中的肺癌。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利申请主张2013年12月30日提交的美国临时专利申请序列号No.61/921,694的优先权，该专利申请的全部内容作为参考并入本文。本专利技术总体上涉及癌症诊断领域，并且更具体地，涉及诊断肺癌的方法。
技术介绍
肺癌是美国男性和女性中癌症死亡的首要原因。在2012年，美国确诊了约226,160例新的肺癌病例，其中164,770例死亡。肺癌的五年存活率为约16％。这种不容乐观的状况主要是由于大部分患者在有表现时已处于疾病晚期。非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌诊断的约85％。对于该亚组的患者，如果较早发现(I期和II期)，则手术通常是治愈性的。不幸的是，仅有约30％的诊断落入该早期阶段分类的范围。将近1/4的美国人口主动吸烟，并同时促进了二手烟的下游效应。尽管预防仍是阻止肺癌流行的最重要策略，但在目标实现前，仍需要新型的改善的早期诊断方法。国家肺癌筛查试验(NationalLungScreeningTrial，NLST)已确定性地建立了计算机断层(CT)筛选肺癌高风险患者的作用，即年龄超过55岁且每天一包烟，烟龄在30年或以上的目前或近期的吸烟者。尽管在死亡率方面有益，但是仍考虑了提供筛查护理的成本，以及由96％的假阳性率所造成的不必要程序。此外，尽管已存在风险预测模型，但也能未完全诊断由于所担心的结节而密切注意的那些患者。因此，生物标志物对于进一步划分可能受益于治愈性目的的治疗而不是观察等待的患者而言是很关键的。尽管多种无创血液生物标志物已作为临床相关产品出售，但是只有少数进入诊所。尽管努力使新技术进入诊所，但是临床上已使用数十年的癌症生物标志物(如癌胚抗原(CEA)和甲胎蛋白(AFP))仍是次最优的护理标准。现代高维基因组和蛋白质测定受限于涉及测定来自高维数据组的数千个特征(如蛋白质和微小RNA)的技术和统计变差。分析受到较少技术变化影响的较简单的特征是有吸引力的，并且这可能潜在地使有意义的生物标志物更快速地进入诊所。循环肿瘤细胞(CTC)代表一种潜在的进步，并且由于它们的无创测量而使其更具有吸引力。Cristofanilli等人，NEnglJMed351：781-91，(2004)。文献中关于CTC的报道已有一个世纪，其主要是作为对病理研究探索而报道的，但是在2004年，食品和药物管理局(FoodandDrugAdministration)批准了通过使用经由上皮细胞粘附分子检测(EpCAM)的给予免疫磁性的抗体捕获平台(CellSearch，TMVeridex，RaritanNJ)，使用CTC计数来监控晚期癌症中对治疗的应答。CellSearchTM是首个通过使CTC平台标准化来证明临床应用的技术，并且预期观察数据已确认CTC负担与治疗应答和多种类型的晚期癌症中的预后有关。然而，由于检测灵敏度差，因此在早期疾病中使用CellSearchTM的CTC检测已不太有希望。存在技术上更灵敏的其他类型的平台，其通过依赖于EpCAM和独立于EpCAM的技术来富集CTC群体，并且对于非转移性癌症能够检测到2-3log倍的CTC提高。到目前为止，尚未对CTC测定很好地研究其对肺结节分类的风险以确定CTC是否可以是有帮助的诊断辅助。仍需要诊断肺癌高风险患者的准确且无创性诊断方法。通过向已有的临床和成像信息中加入CTC数据以提高进行肺癌评价的患者的诊断准确度，本专利技术解决了这种需要。还提供了相关优势。专利技术概述本专利技术提供了用于诊断受试者中肺癌的方法，包括：(a)基于直接分析从获自受试者的血液样品中产生循环肿瘤细胞(CTC)数据，所述直接分析包括所述样品中有核细胞的免疫荧光染色和形态特征，其中基于所述免疫荧光染色和形态特征在周围的有核细胞的背景中鉴别CTC；(b)获得所述受试者的临床数据；(c)将所述CTC数据与临床数据组合以诊断所述受试者中的肺癌。在一些实施方式中，临床数据包括一个或多个部分的成像数据。在其他实施方式中，临床数据包括一个或多个个体风险因素。在一些实施方式中，肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方式中，肺癌为早期肺癌。在一些实施方式中，肺癌为I期肺癌。在其他实施方式中，所述受试者是非小细胞肺癌(NSCLC)的高风险受试者。在其他实施方式中，CTC数据是通过荧光扫描显微术产生的。在其他实施方式中，所述方法包括通过广谱细胞角蛋白(pancytokeratin)、分化簇(CD)45和二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的有核细胞的免疫荧光染色。在其他实施方式中，CTC包括来自周围的有核细胞的明显的免疫荧光染色。在其他实施方式中，CTC包括与周围的有核细胞相比的明显的形态特征。在一些实施方式中，诊断表示为风险得分。根据详细说明和权利要求，本专利技术的其他特征和优势将是显而易见的。附图说明图1.用于建模的HD-CTC和肿瘤簇。部分(A)显示了来自I期腺癌患者的HD-CTC的合成图像，随后是限定HD-CTC的单独的DAPI阳性(蓝色，B)、细胞角蛋白阳性(红色，C)和CD45阴性(绿色，D)通道。作为合成图像和单独的通道，显示了HD-CTC双重组合(部分E-H)、三重组合(部分I-L)和大于8个HD-CTC的“大”簇(部分M-P)。将簇定义为具有接触细胞质的大于一个CTC(参见方法)以用于进一步建模。图2.患者流。这是经历有关肺结节评价或非小细胞肺癌(NSCLC)分级的患者的预期、观察研究。由于血液处理错误、缺少明确诊断或非NSCLC诊断或争议性癌症，患者的排除获得了NSCLC和良性患者的第一分析组，然后是仅I期亚组vs.仅良性患者的第二分析。在训练组(n＝88)中探索所关心的临床、成像和HD-CTC变量，并在测试组(n＝41)中验证。图3.仅HD-CTC以及与临床和成像数据整合的接受器工作特征(ROC)曲线。在训练(灰色虚线)、测试(黑色实线)和全部(灰色实线)组中，对所有NSCLC患者和仅I期疾病患者显示了用于以下模型的接受器工作特征(ROC)曲线：结合了单独的HD-CTC(A)、7.5个HD-CTC/mL的阈值(B)和HD-CTC簇(存在或不存在)(C)。在每幅图的右下角以95％的置信区间显示了每个群组的AUC。HD-CTC自身不能高度区分癌症，但是与临床和成像数据结合，与良性病变相比，在NSCLC和I期患者中观察到了强烈的信号。图4.补充表1.使用HD-CTC测定，通过循环上皮细胞对25位良性患者的分析图5.补充表2.通过模型的逻辑回归系数。对于风险得分计算，如下定义变量：年龄：存活年数；性别：男性＝1，女性＝0；吸烟史：无＝0，过往＝1，目前＝2；癌症史：无＝0，是＝1；直径：以厘米为单位的最大直径尺寸；病灶位置：下肺叶＝0，上肺叶＝1；HD-CTC簇：无＝0；任何＝1。图6.疾病组评价的变量。通过良性(n＝25)或NSCLC诊断(n＝104)显示了临床(年龄)、成像(结节直径和SUVmax)和HD-CTC变量(CTC浓度和总CTC、肿瘤簇、CTC大小[小细胞或“SHC”和核面积]和荧光强度[CK强度和CK阴性细胞，“DHC”])。图7.变量相关性。通过分级聚类显示了用于分析的临床变量(年龄、性别、吸烟史和癌症史)、成像变量(肿瘤直径、位置和SUVmax)和HD-CTC变量(包括CTC、簇、本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于诊断受试者中肺癌的方法，包括(a)基于直接分析从获自受试者的血液样品中产生循环肿瘤细胞(CTC)数据，所述直接分析包括所述样品中有核细胞的免疫荧光染色和形态特征，其中，基于所述免疫荧光染色和形态特征的组合，在周围的有核细胞的背景中鉴别CTC；(b)获得所述受试者的临床数据；(c)将所述CTC数据与临床数据组合，以诊断所述受试者中的肺癌。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.30 US 61/921,6941.用于诊断受试者中肺癌的方法，包括(a)基于直接分析从获自受试者的血液样品中产生循环肿瘤细胞(CTC)数据，所述直接分析包括所述样品中有核细胞的免疫荧光染色和形态特征，其中，基于所述免疫荧光染色和形态特征的组合，在周围的有核细胞的背景中鉴别CTC；(b)获得所述受试者的临床数据；(c)将所述CTC数据与临床数据组合，以诊断所述受试者中的肺癌。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述临床数据包括一个或多个部分的成像数据。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述临床数据包括一个或多个个体风险因素。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)。5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述NSCLC为I期NSCLC。6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述CTC数据是通过荧光扫描显微术产生的。7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述CTC数据是通过评价至少400万个所述有核细胞产生的。8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述显微术提供了包含CTC和超过200个周围的白细胞(WBC)的视场。9.根据权利要求6所述的方法，其中，有核细胞的所述免疫荧光染色包括广谱细胞角蛋白、分化簇(CD)45和二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)。10.根据权利要求6所述的方法，其中，所述CTC包括不同于周围的有核细胞的免疫荧光染色。11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述不同的免疫荧光染色包括DAPI(+)、CK(+)和CD45(-)。12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述CTC包括与周围的有核细胞相比不同的形态特征。13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述形态特征包括由核尺寸、核形状、细胞尺寸、细胞形状和核质比组成的组中的一种或多种。14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述形态特征还包括由核详细情况、核轮廓、是否存在核仁、细胞质质量和细胞质数量组成的组中的一种或多种。15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述CTC的鉴别还包括将广谱细胞角蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·昆，安德斯·卡尔松，A·考拉特卡，桑吉夫·萨姆·甘比尔，维斯瓦姆·S·奈尔，
申请(专利权)人：斯克利普斯研究所，小利兰·斯坦福大学理事会，
类型：发明
国别省市：美国;US