一种利用液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺的方法，包括步骤：标准品制备，液相色谱分离，质谱检测并制标准曲线，血浆中儿茶酚胺的检测。本发明专利技术的方法创新性地应用高通量液相色谱串联三重四级杆质谱仪进行儿茶酚胺的检测，具有以下有益效果：采用乙腈进行蛋白沉淀，丹磺酰氯进行衍生化反应，提取后使用液相色谱串联三重四级杆质谱仪检测，前处理步骤简单，可以有效去除血浆基质干扰，特异性好；通过丹磺酰氯衍生化后，能有效提高检测灵敏度；高通量液相色谱串联质谱仪进行检测，同时定性并精准定量血浆中包括多巴胺，肾上腺素，去甲肾上腺素的3种儿茶酚胺，检测时间短，通量高，检测灵敏度高，特异性好，成本低廉。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及儿茶酚胺检测的
，尤其涉及一种利用液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺的方法。
技术介绍
儿茶酚胺是一种含有儿茶酚和胺基的神经类物质，包括肾上腺素(epinephrine，E)、去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)、多巴胺(dopamine，DA)，是由肾上腺髓质和一些交感神经元嗜铬细胞分泌的一类非常重要的神经递质，也是重要的激素物质。这三种儿茶酚胺都是由酪氨酸为前提转化得到的。去甲肾上腺素和肾上腺素既是肾上腺髓质所分泌的激素，又是交感神经和中枢神经系统中去甲肾上腺素能纤维的神经介质。去甲肾上腺素在中枢神经系统内分布广泛，含量较多，而肾上腺素含量则较少。多巴胺主要集中在锥体外系部位，也是一种神经介质，它们是重要的典型的肾上腺素受体激动剂。儿茶酚胺在人体的心血管系统、神经系统、内分泌腺、肾脏、平滑肌等组织系统的生理活动中起着广泛的调节作用，同时还影响人体的代谢。检测血浆中的儿茶酚胺对于嗜铬细胞瘤、神经母细胞瘤、高血压、心衰、肾上腺髓质增生等疾病的临床诊断具有重要意义，并且有助于甲亢、甲低、充血性心衰、糖尿病、肾功能不全、低血糖症等疾病的诊断。目前常用的儿茶酚胺检测方法主要有放射酶学法、化学发光法、荧光法和高效液相色谱法等，这些检测方法主要存在以下一些问题：第一，血浆样品前处理过程复杂，并且需要起始样品量较大；第二，现有检测技术过程时间长，实验误差较大，通量低；第三，由于肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素分子量一样，结构非常类似，无法用常规检测方法区分，特异性较差。
技术实现思路
为了解决以上技术问题，本专利技术提供一种利用液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺的方法，这种方法样品前处理简单，可以同时检测3种儿茶酚胺，检测特异性好，并且整个检测流程时间短、通量高。本专利技术的一种利用液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺的方法，包括如下步骤：1)标准品制备：分别取若干不同浓度的儿茶酚胺乙腈溶液，分别加入等量的含已知浓度内标的乙腈溶液，备用；在避光条件下，利用衍生化试剂丹磺酰氯对加入内标的儿茶酚胺乙腈溶液，进行衍生化处理使得儿茶酚胺发生化学反应，以提高儿茶酚胺在质谱上的信号响应信号；反应完后加入甲酸水溶液调节使pH＝7，离心后取样品上清液于96孔板上备用，用于液相色谱串联质谱上样分析，完成标准品的制备；2)液相色谱分离：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在反向C18分析柱上对标准品中儿茶酚胺进行色谱洗脱分离，通过控制洗脱条件，分离出肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺；3)质谱检测并制标准曲线：液相色谱上分离出的3种儿茶酚胺进入到三重四级杆质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测3种儿茶酚胺的含量，根据信号噪音比计算得到定量检测限与鉴定检测限，根据比值以及已知标准品和内标浓度值绘制标准曲线图并得到定量校正方程；4)血浆中儿茶酚胺的检测：取血浆样本，加入含已知浓度内标的乙腈溶液进行蛋白沉淀，充分沉淀后第一次离心，移取血浆上清液并进行冷冻干燥；在避光条件下，利用衍生化试剂丹磺酰氯对血浆上清液进行衍生化处理使得儿茶酚胺发生化学反应，以提高儿茶酚胺在质谱上的信号响应信号；反应完后加入甲酸水溶液调节使pH＝7，第二次离心后取样品上清液于96孔板上备用，用于液相色谱串联质谱上样分析；液相色谱串联质谱分析同步骤2)和3)，质谱检测得到儿茶酚胺与内标的比值，将比值代入到定量校正方程，计算得到血浆中儿茶酚胺的含量。进一步的，所述步骤1)中内标为氘代香草扁桃酸，所述含已知浓度内标的乙腈溶液的浓度为25nmol/L。进一步的，所述步骤1)中若干不同浓度的儿茶酚胺乙腈溶液的浓度均控制在1pmol/L～1umol/L之间。进一步的，所述步骤1)和4)中衍生化试剂丹磺酰氯具体为：4mg/mL的丹磺酰氯乙腈溶液和0.1MpH＝11.0的Na2CO3–NaHCO3缓冲溶液按体积比为3:1的混合溶液，衍生化反应条件为：35℃避光反应30min。进一步的，所述步骤1)和4)中甲酸水溶液为体积分数15％的甲酸水溶液。进一步的，所述步骤1)中离心的条件为温度4℃，离心力18000g，时间5min。进一步的，所述步骤4)中血浆与含内标乙腈溶液的体积比为1:3，第一次离心的条件为温度4℃，离心力18000g，时间10min；第二次离心的条件为温度4℃，离心力18000g，时间5min。进一步的，所述步骤2)中，液相色谱条件为：色谱柱：WatersACQUITYUPLCBEHC18Column:poresizeparticlesize1.7μm,2.1mm×50mm；cat.#186002350IVD；色谱柱柱温：25℃；进样量：15ul；流速：0.3ml/min；流动相组成：A相(20mM醋酸铵和0.1％甲酸水溶液，体积分数)，B相(0.1％甲酸-乙腈溶液，体积分数)；进一步的，所述步骤3)中，质谱条件为：质谱为WatersXevoTQDIVD(Waters,Milford,MA)；质谱检测条件如下：电喷雾针电压：3.2kV，去溶剂气流速：800L/h，去溶剂气温度：400℃，锥孔气流速：50L/h，检测为阳离子模式，多重反应监控，检测驻留时间为25ms。本专利技术的一种利用液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺的方法创新性地应用高通量液相色谱串联三重四级杆质谱仪进行儿茶酚胺的检测，具有以下有益效果：采用乙腈进行蛋白沉淀，丹磺酰氯进行衍生化反应，提取后使用液相色谱串联三重四级杆质谱仪检测，前处理步骤简单，可以有效去除血浆基质干扰，特异性好；通过丹磺酰氯衍生化后，能有效提高检测灵敏度；高通量液相色谱串联质谱仪进行检测，同时定性并精准定量血浆中包括多巴胺，肾上腺素，去甲肾上腺素的3种儿茶酚胺，检测时间短，通量高，检测灵敏度高，特异性好，成本低廉。附图说明图1为本专利技术的方法步骤示意图；图2为本专利技术中液相色谱定性儿茶酚胺及内标氘代香草扁桃酸的色谱图；图3为本专利技术中儿茶酚胺肾上腺素的质谱标准曲线图；图4为本专利技术中儿茶酚胺多巴胺的质谱标准曲线图；图5为本专利技术中儿茶酚胺去甲肾上腺素的质谱标准曲线图。具体实施方式下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。3种儿茶酚胺标准品(肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺)以及相应同位素标记的内标(氘代香草扁桃酸，D3-VMA)均采购自SigmaAldrich公司。标准品和内标首先用乙腈进行溶解，然后保存在-80℃，需要进行实际样品检测时，再利用乙腈将这些内标稀释到约25nM浓度作为工作液。如图1所示，本实施例的一种利用液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺的方法，包括如下步骤：1)标准品制备：分别取0.3ml不同浓度的儿茶酚胺乙腈溶液到1.5mlEP管中，再分别加入0.9ml低温保存的含内标氘代香草扁桃酸乙腈溶液，用旋涡混合器充分混合后，用1mL的移液枪转移1mL含内标氘代香草扁桃酸的儿茶酚胺乙腈溶液到另外一个1.5mlEP管，然后用真空冷冻干燥器冻干；冻干后在避光条件下，向上述1.5mlEP管加入150uL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)标准品制备：分别取若干不同浓度的儿茶酚胺乙腈溶液，分别加入等量的含已知浓度内标的乙腈溶液，备用；在避光条件下，利用衍生化试剂丹磺酰氯对加入内标的儿茶酚胺乙腈溶液，进行衍生化处理使得儿茶酚胺发生化学反应，以提高儿茶酚胺在质谱上的信号响应信号；反应完后加入甲酸水溶液调节使pH＝7，离心后取样品上清液于96孔板上备用，用于液相色谱串联质谱上样分析，完成标准品的制备；2)液相色谱分离：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在反向C18分析柱上对标准品中儿茶酚胺进行色谱洗脱分离，通过控制洗脱条件，分离出肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺；3)质谱检测并制标准曲线：液相色谱上分离出的3种儿茶酚胺进入到三重四级杆质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测3种儿茶酚胺的含量，根据信号噪音比计算得到定量检测限与鉴定检测限，根据比值以及已知标准品和内标浓度值绘制标准曲线图并得到定量校正方程；4)血浆中儿茶酚胺的检测：取血浆样本，加入含已知浓度内标的乙腈溶液进行蛋白沉淀，充分沉淀后第一次离心，移取血浆上清液并进行冷冻干燥；在避光条件下，利用衍生化试剂丹磺酰氯对血浆上清液进行衍生化处理使得儿茶酚胺发生化学反应，以提高儿茶酚胺在质谱上的信号响应信号；反应完后加入甲酸水溶液调节使pH＝7，第二次离心后取样品上清液于96孔板上备用，用于液相色谱串联质谱上样分析；液相色谱串联质谱分析同步骤2)和3)，质谱检测得到儿茶酚胺与内标的比值，将比值代入到定量校正方程，计算得到血浆中儿茶酚胺的含量。...

【技术特征摘要】
1.一种利用液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)标准品制备：分别取若干不同浓度的儿茶酚胺乙腈溶液，分别加入等量的含已知浓度内标的乙腈溶液，备用；在避光条件下，利用衍生化试剂丹磺酰氯对加入内标的儿茶酚胺乙腈溶液，进行衍生化处理使得儿茶酚胺发生化学反应，以提高儿茶酚胺在质谱上的信号响应信号；反应完后加入甲酸水溶液调节使pH＝7，离心后取样品上清液于96孔板上备用，用于液相色谱串联质谱上样分析，完成标准品的制备；2)液相色谱分离：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在反向C18分析柱上对标准品中儿茶酚胺进行色谱洗脱分离，通过控制洗脱条件，分离出肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺；3)质谱检测并制标准曲线：液相色谱上分离出的3种儿茶酚胺进入到三重四级杆质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测3种儿茶酚胺的含量，根据信号噪音比计算得到定量检测限与鉴定检测限，根据比值以及已知标准品和内标浓度值绘制标准曲线图并得到定量校正方程；4)血浆中儿茶酚胺的检测：取血浆样本，加入含已知浓度内标的乙腈溶液进行蛋白沉淀，充分沉淀后第一次离心，移取血浆上清液并进行冷冻干燥；在避光条件下，利用衍生化试剂丹磺酰氯对血浆上清液进行衍生化处理使得儿茶酚胺发生化学反应，以提高儿茶酚胺在质谱上的信号响应信号；反应完后加入甲酸水溶液调节使pH＝7，第二次离心后取样品上清液于96孔板上备用，用于液相色谱串联质谱上样分析；液相色谱串联质谱分析同步骤2)和3)，质谱检测得到儿茶酚胺与内标的比值，将比值代入到定量校正方程，计算得到血浆中儿茶酚胺的含量。2.根据权利要求1所述的一种利用液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺的方法，其特征在于，所述步骤1)中内标为氘代香草扁桃酸，所述含已知浓度内标的乙腈溶液的浓度为25nmol/L。3.根据权利要求1所述的一种利用液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺的方法，其特征在于，所述步骤1)中若干不同浓度的儿茶酚胺乙腈溶液的浓度均控制在1pmol/L～1u...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴超超，高强，彭军，刘鹏，胡志飞，江思，海云，
申请(专利权)人：杭州佰辰医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33