猪细小病毒制造技术

本发明专利技术涉及新猪细小病毒、所述病毒的蛋白和基于所述病毒及其蛋白的疫苗。本发明专利技术也涉及包含所述病毒的基因的DNA片段和基于所述病毒的基因的DNA疫苗。另外，本发明专利技术涉及与所述新病毒反应的抗体和用于检测所述病毒或针对所述病毒的抗体的诊断测试。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及新猪细小病毒、所述病毒的蛋白和基于所述病毒及其蛋白的疫苗。本专利技术也涉及包含所述病毒的基因的DNA片段和基于所述病毒的基因的DNA疫苗。另外，本专利技术涉及可与所述新病毒反应的抗体和用于检测所述病毒或针对所述病毒的抗体的诊断测试。在最近的数十年中，观察到猪肉消费的世界性强烈增加。结果，观察到农场的数目和大小的增加，以便满足逐渐增大的市场需求。如从畜牧业已知的，一般而言，亲密地一起生活的大量动物易发所有种类的疾病，甚至在大规模商业畜牧之日之前几乎没有知道或见到或甚至未知的疾病。现在已经知道超过60年的猪疾病之一是出血性肠综合征(HBS)。该疾病由于以下事实而被称作综合征：该疾病的原因不清楚，并且各种临床体征的一致性不总是完全清楚。HBS是一种以频繁的爆炸性爆发而发生的疾病。主要影响4-6个月龄的快速生长中的猪。在大多数情况下，在育肥猪中观察到该疾病。猪在没有腹泻证据的情况下突然死亡，尽管死亡的程度会变化(1-3)。基于超过16000头猪的瑞士尸体剖检数据表明2.66%的HBS发生率。在美国，据报道HBS造成生长-完成阶段的所有死亡的0.5%-7%(3)。出血性肠综合征不应当视作具有单一原因的单一疾病。HBS的最显著征状是肠出血，经常伴有肠扭转(肠的扭转)。但是，这些征状也是胃溃疡和回肠炎的指征，这使得HBS的诊断复杂化。整个肠的旋转可能发生，从而造成血液汇集和淤积。可以在多达80%的HBS病例中观察到肠扭转(1-3)。该疾病的其它经常注意到的征状是薄肠壁和肠中的带血流体。HBS的精确病原学是不清楚的。如上面指出的，不是具有单一原因，所述综合征的病原学最可能是多因素的。应激、几个环境和管理方面可能起作用。倾向因素可以包括剧烈运动、搬运、打架、拥挤（piling）或不规则进食。没有明确的证据表明传染性病原体(细菌或病毒)可以造成HBS(1,3)，尽管已经从遭受HBS的动物分离出梭菌属（Clostridiumsp.）和大肠杆菌（E.coli）。通过将过滤的来自遭受HBS的动物的肠内容物静脉内地或口服地施用给健康动物来再现疾病的尝试失败了。通过口服接种从被感染的猪分离的大肠杆菌和A型产气荚膜梭菌（Clostridiumperfringens）来再现疾病的尝试同样失败了。另一方面，已知的是，通过在饲料中施用抗生素，可以使所述疾病的频率下降至某种程度。这强化了以下理论，所述疾病实际上是多因素的：例如应激和一种或多种病原体的组合效应。本专利技术的一个目的是，提供与该疾病有关的新传染性病原体以及目的在于与所述疾病斗争或至少降低所述疾病的死亡率的疫苗。此外，本专利技术的一个目的是，提供检测和鉴别所述疾病相关的传染性病原体的方式。近年来，在墨西哥的疾病爆发过程中从几个农场收集诊断出HBS的猪。受影响的猪不具有疾病的早先征状且在疾病的第一体征以后2-6小时之间突然死亡。在尸检时，所述猪表现出小肠中的异常（具体地（i.a.）出血征状）、薄肠壁和肠中的带血流体。在其它器官中没有发现异常，但是观察到增大的、肿胀的淡红色淋巴结。疾病被证实为HBS。针对病毒的存在分析了来自不同农场的尸检受影响的猪的样品，令人惊讶的是，在76%的动物中发现了新病毒。所述病毒并非在所有动物中检测到的事实可能必须考虑在动物的死亡与对它们进行死后切开的时刻之间经过的时间的量。这可以具体地从以下事实推断：在每只动物中发现的病毒的量在很大程度上变化。专利技术人预见到，在其中看起来不存在所述病毒的猪中，这可能是由于在那些猪中存在的病毒的量低于在分析时刻的检测水平的事实。此外，对于该新病毒而言不知道最初病毒复制的位点，且因而在感染以后病毒复制的主要位点可能没有被取样。由于在这些诊断出HBS的猪中检测到新病毒，所述病毒还将被称作HBS相关病毒。出血性肠综合征现在可以通过与下述临床征状组合的、根据本专利技术的新病毒在所述疾病中的某个阶段在遭受HBS的动物的器官中的存在来表征：肠出血，经常伴有肠扭转，薄肠壁和肠中的带血流体。分析了病毒基因组的序列，并揭示所述新病毒与最近鉴别出的细小病毒科（Parvoviridae）内的细小病毒亚科（Parvovirinaesubfamily）的属具有某种（尽管相对低的）水平的相似性。细小病毒是直链的、不分段的单链DNA病毒，具有5000个核苷酸的平均基因组大小和在18-26nm范围内的直径大小。新猪细小病毒的代表的几乎全长DNA序列呈现在SEQIDNO:10中。所述新病毒包含两个大开放读码框(ORF)：在SEQIDNO:10的位置0134-2122处发现了编码由662个氨基酸组成的非结构蛋白1(NS1)的ORF1，和在SEQIDNO:10的位置2130-5699处发现了编码由1189个氨基酸组成的衣壳蛋白(CP)的ORF2。ORF2（编码衣壳蛋白的基因）的DNA序列的一个例子描绘在SEQIDNO:1中。SEQIDNO:2表现了衣壳蛋白的氨基酸序列。编码非结构蛋白NS1的ORF1的DNA序列的一个例子描绘在SEQIDNO:3中。SEQIDNO:4表现了非结构蛋白NS1的氨基酸序列。细小病毒亚科目前包括7个属(15)：1)PARV4-样病毒2)红病毒属3)博卡病毒属4)依赖病毒属5)阿留申病毒属6)细小病毒属7)新提出的细小病毒进化枝在此时，已经鉴别出6种不同的感染猪的细小病毒：a)经典的猪细小病毒1型(PPV1)，细小病毒属的一个成员b)猪细小病毒2型(PPV2)，PARV4-样病毒的一个成员c)猪细小病毒3型(PPV3，也被称作猪PARV4、hokovirus或partetravirus)，也是PARV4-样病毒属的一个成员d)猪细小病毒4型(PPV4)，新提出的进化枝的一个成员e)猪细小病毒5型(PPV5)，也是新提出的进化枝的一个成员f)猪博卡病毒(PBoV)，博卡病毒属的一个成员已知PPV1是SMEDI（一种与死产、木乃伊化、胚胎死亡和不育关联的综合征）的致病因子(4,5)未知PPV2会造成这样的疾病，但是被提示是猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的发生的辅因子(6,7)。也未知PPV3会造成这样的疾病，但是也可能是猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的发生的辅因子(8-11)。PPV4最初分离自猪的肺组织。所述组织似乎被猪圆环病毒共感染。不知道它会造成疾病，并且还没有令人信服地与另一种病原体造成的疾病相关联(12-14)。还未知PPV5会造成任何征状或损害，并且没有与另一种病原体造成的疾病相关联(15-16)。猪博卡病毒一种相对新猪细小病毒类型，其临床意义和流行病学在很大程度上有待探索(17)。基于最大似然法、Poisson校正模型和自举分析(500个重复)，使用所述新病毒的ORF1和ORF2的氨基酸序列来制备系统树。使用程序MEGA,5版，使用标准设置制备这些树(MEGA5:MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysisUsingMaximumLikelihood,EvolutionaryDistance,andMaximumParsimonyMethods.KoichiroTamura,DanielPeterson,NicholasPeterson,GlenStecher,MasatoshiNeian本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的病毒，其为细小病毒科的细小病毒亚科的一个成员，所述病毒特征在于，a)所述病毒是出血性肠综合征(HBS)相关病毒，且b)所述病毒具有包含编码衣壳蛋白(CP)的基因和编码非结构蛋白1 (NS1)的基因的病毒基因组，其中所述CP基因的核苷酸序列与SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平或所述NS1基因的核苷酸序列与SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.17 EP 14165255.21.一种分离的病毒，其为细小病毒科的细小病毒亚科的一个成员，所述病毒特征在于，a)所述病毒是出血性肠综合征(HBS)相关病毒，且b)所述病毒具有包含编码衣壳蛋白(CP)的基因和编码非结构蛋白1(NS1)的基因的病毒基因组，其中所述CP基因的核苷酸序列与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平或所述NS1基因的核苷酸序列与SEQIDNO:3所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。2.根据权利要求1所述的分离的病毒，其特征在于，所述CP基因的核苷酸序列与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平且所述NS1基因的核苷酸序列与SEQIDNO:3所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。3.一种分离的病毒，其为细小病毒科的细小病毒亚科的一个成员，所述病毒特征在于，a)所述病毒是HBS相关的猪细小病毒，且b)所述病毒基因组DNA在PCR反应中与SEQIDNO:5和6所示的引物集合反应以产生140±10碱基对的PCR产物或在PCR反应中与SEQIDNO:7和8所示的引物集合反应以产生853±10碱基对的PCR产物。4.根据权利要求3所述的分离的病毒，其特征在于，所述病毒基因组DNA在PCR反应中与SEQIDNO:5和6所示的引物集合反应以产生140±10碱基对的PCR产物且在PCR反应中与SEQIDNO:7和8所示的引物集合反应以产生853±10碱基对的PCR产物。5.根据权利要求1-4中的任一项所述的分离的病毒，其特征在于，所述CP基因的核苷酸序列与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平且所述NS1基因的核苷酸序列与SEQIDNO:3所示的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平，并且所述病毒基因组DNA在PCR反应中与SEQIDNO:5和6所示的引物集合反应以产生140±10碱基对的PCR产物且在PCR反应中与SEQIDNO:7和8所示的引物集合反应以产生853±10碱基对的PCR产物。6.一种包含病毒的细胞培养物，其特征在于，所述培养物包含根据权利要求1-5中的任一项所述的病毒。7.一种包含编码CP的基因的DNA片段，其特征在于，所述基因的核苷酸序列与SEQIDNO:1所示的CP基因的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。8.一种CP，其特征在于，所述CP由根据权利要求7所述的DNA片段编码。9.一种包含编码NS1的基因的DNA片段，其特征在于，所述基因的核苷酸序列与SEQIDNO:3所示的NS1基因的核苷酸序列具有至少80%的同一性水平。10.一种NS1，其特征在于，所述NS1由根据权利要求9所述的DNA片段编码。11.根据权利要求7所述的DNA片段，其特征在于，所述CP基因是在功能性异源启动子的控制下。12.一种用于与猪中HBS相关的猪细小病毒斗争的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含免疫原性有效量的根据权利要求1-5中的任一项所述的病毒和药学上可接受的载体。13.根据权利要求12所述的疫苗，其特征在于，所述病毒呈活减毒形式。14.根据权利要求12所述的疫苗，其特征在于，所述病毒呈灭活形式。15.一种用于与猪中HBS相关的猪细小病毒斗争的疫苗，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：L格伦，A格罗夫，CC施里尔，M戴吉斯，CM赫克范德，
申请(专利权)人：英特维特国际股份有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL