用于高通量酵母双杂交技术的重组载体及其大规模筛选互作蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于酵母双杂交的相关重组载体及其利用高通量测序技术大规模筛选互作蛋白的酵母双杂交的方法，该方法依赖于一种整合酶Integrase phiC31(En)的特有整合功能，通过对传统酵母双杂交载体的改造，使其与高通量测序技术有机结合，实现成百上千的Bait蛋白同时对Prey蛋白文库的筛选工作。将整合酶及其特异识别的核苷酸序列插入Matchmaker GAL4系统的载体中，通过酵母双杂交的方法使重组载体进入同一个酵母细胞，整合酶发生作用，将其特异识别的核苷酸序列及其紧邻的核苷酸序列进行特异性定向重排，从而使得两个重组载体融合成一个融合载体，此时猎物和诱饵蛋白序列被定向连接成融合载体上的一段新的序列，通过扩增、高通量测序，从而经济高效地筛选相互作用蛋白质并构建全面的蛋白互作网络图谱。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种酵母双杂交筛选方法，具体地指一种用于酵母双杂交的相关载体及其利用高通量测序技术大规模筛选互作蛋白的酵母双杂交的方法。
技术介绍
酵母双杂交技术作为目前研究大规模蛋白质相互作用的主要方法和手段，已经得到了很大发展和越来越广泛的应用。酵母双杂交系统作为研究蛋白间相互作用的最常用的技术手段，最早是由Fields和Song在研究真核基因转录调控中建立的A，其原理是：诱饵蛋白(bait)与BD(DNABindingDomain)，猎物蛋白(pery)与AD(DNAActivationDomain)分别形成融合蛋白，然后通过酵母杂交使两种融合蛋白进入同一酵母细胞，如果bait蛋白和pery蛋白存在互作，就能使BD和AD在空间上相互靠近，使转录因子同时具有识别报告基因上的特异序列以及作用于转录复合体的其他成分的功能，从而形成有活性的转录因子，激活下游报告基因的表达，即表现出杂合的酵母细胞能在营养缺陷型的培养基上生长以及显色，反过来通过杂合酵母细胞在营养缺陷的平板生长情况以及显色反应来判断bait蛋白和pery蛋白是否存在互作。酵母双杂交技术因具有高效、灵敏等优点，故被广泛应用于蛋白组学的研究，但其也有假阳性高、操作复杂等缺点，尤其在大规模互作网络研究方面显得规模小，通量低。虽然现有酵母双杂交技术也在向大规模、自动化、高通量方向发展，建立了自动化工作站以及一系列杂交仪器，而且为了提高整个流程自动化程度，一些来源于高通量实验的蛋白质相互作用数据库也已经涌现。然而，随着近年来高通量测序技术的应运而生，多种物种基因组测序成功，大规模、高通量的研究方法在基因组和蛋白质组研究中也显得日趋重要，此时酵母双杂交方法在大规模蛋白互作网络研究方面就显得规模小，通量低。因为此技术只能应用于单个Bait蛋白(X)对互作Prey蛋白(Y)筛选，筛选到的阳性克隆需要逐一进行测序鉴定，将会有成百上千的克隆挑选、PCR和纯化以及测序工作。操作复杂，工作量大且耗时。当要进行多个甚至上百个Bait蛋白的互作蛋白筛选时，只能对一个个诱饵Bait蛋白分别和猎物Prey蛋白文库进行单独筛选，不能将所有诱饵Bait蛋白和猎物Prey蛋白文库进行同时筛选，所造成的人力资源等的浪费，一般的实验室无法承受，从而无法快速建立信息丰富的蛋白互作网络。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种用于酵母双杂交的相关重组载体及其利用高通量测序技术大规模筛选互作蛋白的酵母双杂交的方法。该方法依赖于一种整合酶IntegrasephiC31(En)特有的整合功能。该整合酶能识别到特异核苷酸序列ATTP和ATTB，并将特异核苷酸序列及其紧邻的核苷酸序列进行特异性定向重排并连接成一段新的序列。将整合酶和特异识别的核苷酸序列ATTP和ATTB分别插入MatchmakerGAL4系统的载体pGADT7和pGBKT7(Clontech)中，并分别与猎物蛋白和诱饵蛋白序列融合，通过酵母双杂交的方法导入同一个酵母细胞，筛选互作蛋白的同时，整合酶发生作用，将ATTP和ATTB及其相连的猎物和诱饵蛋白核苷酸序列被定向连接成一段新的序列，从而使得两个重组载体融合成一个融合载体，此时猎物和诱饵蛋白序列被定向连接成融合载体上的一段新的序列(图1)，继而实现了成百上千的Bait蛋白同时对Prey蛋白文库的筛选工作。而且我们在导入Prey蛋白和Bait蛋白的基因序列的同时，在prey和bait基因C端引入一个MmeI限制性酶切位点(MmeI是一种较为特殊的限制性内切酶，其特点是酶切其上游19-21个核苷酸序列)，经过MmeI对连接产物的限制性酶切后，得到大小相同但序列完全不同的互作蛋白对，然后酶切产物连接高通量测序的引物，利用高通量测序一次性获得所有的互作蛋白，从而完成酵母双杂交技术与高通量测序技术的有机结合，经济高效构建出全面的蛋白互作网络图谱，为各学科领域研究蛋白的功能机制提供了强有力的技术保障。该方法克服了现有酵母双杂交方法规模小，通量低，无法进行文库对文库的筛选以及大规模互作网络研究的缺点。为实现上述目的，本专利技术提供的一种用于酵母双杂交的重组载体pGADT7-ATTP-phiC31，所述重组载体pGADT7-ATTP-phiC31是在载体pGADT7上插入solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列和PolIII::phic31-Cyc1表达盒，所述solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列替换NdeⅠ和XhoⅠ之间的序列及其XhoⅠ酶切位点，所述PolIII::phiC31-Cyc1表达盒插入在NheⅠ上，其中，solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，PolIII::phiC31-Cyc1表达盒如SEQIDNO：2所示。本专利技术提供了上述用于酵母双杂交的重组载体pGADT7-ATTP-phiC31的构建方法，包括以下步骤：1)合成solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列，以solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列为模板设计带有同源臂的全长引物对，其引物对如下：Sol-Fo：gacgtaccagattacgctcatatgagaatgatacggcgaccaccg，ATTP-Re：ctacgattcatctgcagctcgacagtgccccaactggggtaac；PCR扩增，回收纯化得到含有同源臂的solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；2)将载体PGADT7用NdeⅠ和XhoⅠ进行酶切处理，酶切体系如下：37℃酶切6～8h，纯化回收得到线性化的载体PGADT7；3)将线性化的载体PGADT7和上述含有同源臂的solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列进行同源重组，筛选阳性克隆，并命名为PGADT7-ATTP；4)以酿酒酵母YSR127gDNA模板设计引物对，引物对如下：NheI-PolIII-Fo：gggctagctgccaattgaacataacatg，PolIII-phiC31-Re：ctgggagctgcgattggcaatgacacaaggggttgtgac；PCR扩增，回收纯化得到PolIII启动子；5)以phiC31ORF为模板设计全长引物对，其引物对如下：phiC31-PolIII-Fo：ctgggagctgcgattggcaatgacacaaggggttgtgac，phiC31-cyc1-Re：attggaagttggatatggggttatacgtcttccgtgccgtc；PCR扩增，回收纯化得到phiC31ORF；6)以酿酒酵母YSR127gDNA模板设计引物对，引物对如下：cyc1-phiC31-Fo：gacggcacggaagacgtataaccccatatccaacttccaat，NheI-cyc1-Re：gggctagcgactgtgtcaatgacttcac；PCR扩增，回收纯化得到PolIII终止子；7)以上述步骤4)、5)和6)得到的PolIII启动子、phiC31ORF及Cyc1终止子为模板，以NheI-PolIII-Fo和NheI-cyc1-Re为引物overlapPCR扩增表达盒PolIII::phiC31-Cyc1表达盒如SEQIDNO：2所示本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于酵母双杂交的重组载体pGADT7‑ATTP‑phiC31，其特征在于：所述重组载体pGADT7‑ATTP‑phiC31是在载体pGADT7上插入solexa PE1‑MCS‑ATTP核苷酸序列和PolIII::phiC31‑Cyc1表达盒，所述solexa PE1‑MCS‑ATTP核苷酸序列替换Nde Ⅰ和Xho Ⅰ之间的序列及其Xho Ⅰ酶切位点，所述PolIII::phiC31‑Cyc1表达盒插入在NheⅠ上，其中，solexa PE1‑MCS‑ATTP核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，PolIII::phiC31‑Cyc1表达盒如SEQ ID NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于酵母双杂交的重组载体pGADT7-ATTP-phiC31，其特征在于：所述重组载体pGADT7-ATTP-phiC31是在载体pGADT7上插入solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列和PolIII::phiC31-Cyc1表达盒，所述solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列替换NdeⅠ和XhoⅠ之间的序列及其XhoⅠ酶切位点，所述PolIII::phiC31-Cyc1表达盒插入在NheⅠ上，其中，solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，PolIII::phiC31-Cyc1表达盒如SEQIDNO：2所示。2.一种权利要求1所述用于酵母双杂交的重组载体pGADT7-ATTP-phiC31的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：1)合成solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列，以solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列为模板设计带有同源臂的全长引物对，其引物对如下：Sol-Fo：gacgtaccagattacgctcatatgagaatgatacggcgaccaccg，ATTP-Re：ctacgattcatctgcagctcgacagtgccccaactggggtaac；PCR扩增，回收纯化得到含有同源臂的solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；2)将载体PGADT7用NdeⅠ和XhoⅠ进行酶切处理，纯化回收得到线性化的载体PGADT7；3)将线性化的载体PGADT7和上述含有同源臂的solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列进行同源重组，筛选阳性克隆，并命名为PGADT7-ATTP；4)以酿酒酵母YSR127gDNA模板设计引物对，引物对如下：NheI-PolIII-Fo：gggctagctgccaattgaacataacatg，PolIII-phiC31-Re：ctgggagctgcgattggcaatgacacaaggggttgtgac；PCR扩增，回收纯化得到PolIII启动子；5)以phiC31ORF为模板设计全长引物对，其引物对如下：phiC31-PolIII-Fo：ctgggagctgcgattggcaatgacacaaggggttgtgac，phiC31-cyc1-Re：attggaagttggatatggggttatacgtcttccgtgccgtc；PCR扩增，回收纯化得到phiC31ORF；6)以酿酒酵母YSR127gDNA模板设计引物对，引物对如下：cyc1-phiC31-Fo：gacggcacggaagacgtataaccccatatccaacttccaat，NheI-cyc1-Re：gggctagcgactgtgtcaatgacttcac；PCR扩增，回收纯化得到PolIII终止子；7)以上述步骤4)、5)和6)得到的PolIII启动子、phiC31ORF及PolIII终止子为模板，以NheI-PolIII-Fo和NheI-cyc1-Re为引物overlapPCR扩增，回收纯化得到PolIII::phiC31-Cyc1表达盒如SEQIDNO：2所示；8)将改造后载体PGADT7-ATTP和上述PCR产物PolIII::phiC31-Cyc1表达盒分别用NheI酶切处理，进行连接，筛选阳性克隆，获得最后重组载体PGADT7-ATTP-phic31，简称pmGADT7。3.根据权利要求2所述用于酵母双杂交的重组载体pGADT7-ATTP-phic31的构建方法，其特征在于：所述步骤1)中，PCR扩增体系：PCR仪程序：，所述步骤4)中，PCR扩增体系：PCR仪程序：，所述步骤5)中，PCR扩增体系：PCR仪程序：，所述步骤6)中，PCR扩增体系：PCR仪程序：，所述步骤7)中，PCR扩增体系：PCR仪程序：4.一种用于酵母双杂交的重组载体pGBKT7-ATTB-phiC31，其特征在于：所述重组载体pGBKT7-ATTB-phiC31是在载体pGBKT7上插入solexaPE2-MCS-ATTB核苷酸序列和PolIII::phiC31-Cyc1表达盒，所述solexaPE2-MCS-ATTB核苷酸序列替换NdeⅠ和XhoⅠ之间的序列及其XhoⅠ酶切位点，所述PolIII::phiC31-Cyc1表达盒插入在AvrⅡ上，其中，所述solexaPE2-MCS-ATTB核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，所述PolIII::phiC31-Cyc1表达盒如SEQIDNO：2所示。5.一种权利要求4所述用于酵母双杂交的重组载体pGBKT7-ATTB-phiC31的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：1)合成solexaPE2-MCS-ATTB核苷酸序列，以solexaPE2-MCS-ATTB核苷酸序列为模板设计带有同源臂的全长引物对，其引物对如下：BD-Sol-Fo：gatctcagaggaggacctgcatatgacaagcagaagacggcatacg，BD-ATTB-Re：ctagttatgcggccgctgcagggagtacgcgcccggggagc；PCR扩增，回收纯化得到含有同源臂的solexaPE2-MCS-ATTB核苷酸序列；2)将载体PGBKT7用NdeⅠ和XhoⅠ进行酶切处理，纯化回收得到线性化的载体PGBKT7；3)将线性化的载体PGBKT7和上述含有同源臂的solexaPE2-MCS-ATTB核苷酸序列进行同源重组，筛选阳性克隆，并命名为PGBKT7-ATTB；4)以酿酒酵母YSR127gDNA模板设计引物对，引物对如下：AvrⅡ-PolIII-Fo：ggcctaggtgccaattgaacataacatg，PolIII-phiC31-Re：ctgggagctgcgattggcaatgacacaaggggttgtgac；PCR扩增，回收纯化得到PolIII启动子；5)以phiC31ORF为模板设计全长引物对，其引物对如下：phiC31-PolIII-Fo：ctgggagctgcgattggcaatgacacaaggggttgtgac，phiC31-cyc1-Re：attggaagttggatatggggttatacgtcttccgtgccgtc；PCR扩增，回收纯化得到phiC31ORF；6)以酿酒酵母YSR127gDNA模板设计引物对，引物对如下：cyc1-phiC31-Fo：gacggcacggaagacgtataaccccatatccaacttccaat，AvrⅡ-cyc1-Re：ggcctagggactgtgtcaatgacttcac；PCR扩增，回收纯化得到PolIII终止子；7)以上述步骤4)～6)中得到的PolIII启动子、phiC31ORF及PolIII终止子为模板，以AvrⅡ-PolIII-Fo和AvrⅡ-cyc1-Re为引物overlapPCR扩增表达盒PolIII::phiC31-Cyc1表达盒；PCR扩增，回收纯化得到PolIII::phiC31-Cyc1表达盒；8)将改造后载体PGBKT7-ATTB和上述PCR产物PolIII:phiC31：Cyc1表达盒分别用AvrⅡ酶切处理，进行连接，筛选阳性克隆，获得最后重组载体PGBKT7-ATTB-phiC31，简称pmGBKT7。6.根据权利要求5所述用于酵母双杂交的重组载体pGBKT7-ATTB-phiC31的构建方法，其特征在于：所述步骤1)中，PCR扩增体系：PCR仪程序：，所述步骤4)中，PCR扩增体系：PCR仪程序：，所述步骤5)中，PCR扩增体系：PCR仪程序：，所述步骤6)中，PCR扩增体系：PCR仪程序：所述步骤7)中，PCR扩增体系：PCR仪程序：7.利用高通量测序技术大规模筛选互作蛋白的酵母双杂交的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)用于酵母双杂交的重组载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹罡，杨芳，周美玲，雷莹莹，姚琪利，韩以超，朱成航，伍享，戴金霞，宋云峰，陈西，曾思华，傅振芳，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42