一种高效、快速筛选HIV P24抗原核酸适配体的方法技术

本发明专利技术公开一种高效、快速筛选HIV P24抗原核酸适配体的方法。该发明专利技术利用消减指数富集的配体系统进化(SELEX)技术和qPCR等技术，采用链霉亲和素制备单链DNA，再用TPBS洗去非特异性单链DNA，商品化的羧基化琼脂磁珠作为分离介质进行selex筛选，从随机寡核苷酸文库中筛选获得HIV P24核心抗原适配体，从而提高了筛选效率，因此该方法可作为一种早期检测技术，为临床检测提供了一种高灵敏度、低成本和操作简便的方法，为治疗肿瘤提供了一种新的特异性载体，为筛选其它单一靶蛋白和肿瘤血清标志物核酸适配体奠定了基础。该方法筛选效率高、周期短、成本低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术检测领域，涉及一种新的核酸适配体筛选方法，特别是一种高效、快速筛选HIVP24抗原核酸适配体的方法。
技术介绍
在2004年，全球估计有3590至4430万人与人类免疫缺陷病毒相伴生存，其中430至640万人属于新发感染病例，另外，有280至350万人死于艾滋病。这些数字并在不断增长中，其中，东亚、东欧、中亚等地区涨幅最快。HIV感染后可刺激机体生产囊膜蛋白(Gp120,Gp41)抗体和核心蛋白(P24)抗体。DNA适配体相比于抗体/抗原检测具有以下优点：(1)DNA适配体更稳定，不易降解，可长期保存；(2)与靶分子结合力更强，甚至强于天然配基；(3)筛选周期较短，一般仅需1-2个月；(4)无免疫原性；(5)变性，复性速度较快，可反复使用，以及在室温下运输，保存；(6)相对于抗体，寡核苷酸适配体不具有效应器功能；(7)灵敏度高，可进行化学修饰，成本低等优点。而目前国内外检测HIV方法用的是ELISA、免疫共沉淀法等方法，灵敏度低，成本高。因此提高灵敏度、降低检测成本具有重要的意义。核酸适配体在早期检测中能检测到pmol数量级的物质，所以对早期检测具有重要意义。核酸适配体无免疫原性，易于修饰，变性、复性速度较快，可反复使用等优点，为早期检测提供一种高灵敏度、低成本的检测技术。现已有文献表明已有筛选HIVP24抗原核酸适配体的研究，但结果均是未筛选出目标适配体。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种高效、快速筛选获得HIVP24抗原核酸适配体的方法，以及提供一种早期检测技术。本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案是：一种高效、快速筛选HIVP24抗原核酸适配体的方法，其特征在于：以羧基化琼脂磁珠为介质，进行6轮筛选，选出HIVP24抗原的高特异性核酸适配体。所述6轮筛选是用两轮正筛和四轮反筛筛选得到HIVP24抗原的高特异性核酸适配体。所述高效、快速筛选HIVP24抗原核酸适配体的方法包括以下步骤：(1)ssDNA文库的处理；(2)取0.3ml磁珠于1.5mLEP管中，加入300ulHIVP24抗原，37℃，孵育2h，弃去EP管中的抗原，加入500uL封闭液，37℃，1h，结合初级ssDNA文库，37℃，孵育1h；(3)弃去未结合ssDNA文库，用筛选缓冲液洗3次，每次1min，加入200ul去离子水，95℃，10min，收集上清，作为下一轮筛选的次级库；(4)取磁珠0.15mL，加入150uL已稀释100倍的HIVP24抗原，结合次级库，重复步骤(2)的步骤；(5)正筛管：取磁珠0.15mL，加入已稀释100倍的150uLHIVP24抗原，37℃，孵育1h，用筛选缓冲液洗3次，每次1min，然后加入500uL封闭液，37℃，1h；(6)qPCR扩增获得dsDNA：dsDNA反应体系见表1，在上述PCR反应体系中加入80ul模板，充分混匀，每管30ul，分成8管，qPCR进行扩增，S型曲线达到最高点停止扩增；表1dsDNAqPCR反应体系(7)取0.1mL链霉亲和素磁珠于1.5mLEP管中，加入扩增后的dsDNA，37℃，孵育30min，弃取上清液，用500ul的TPBS，37℃水浴，每次4min,重复3次，用水洗1次，加入200uL结合缓冲液，95℃，5min，收集上清液，然后将上清液加入到反筛管中，37℃，孵育45min，将未结合的ssDNA文库再与正筛管于37℃，旋转孵育1h，除去未结合的ssDNA文库；(8)正筛管和反筛管都用筛选缓冲液洗3次，每次3min，各加入200ul去离子水，95℃，5min，收集上清，作为下一轮筛选的次级库；(9)富集效果监测：按照表2所示反应体系添加试剂，充分混匀后，分为4管，每管20ul；取分好的3管体系，各加入10ul正筛管上清、反筛管上清、去离子水，qPCR进行检测；表2集效果监测qPCR反应体系(10)重复上述筛选步骤，在第3轮反筛管磁珠中加入已稀释100倍的150uLHIVgp41抗原，并在每轮筛选中加入tRNA非特异性竞争剂进行筛选，增加筛选的特异性，共进行6轮筛选，各轮SELEX筛选条件见表3；表3各轮SELEX筛选条件本专利技术大大的缩短了筛选周期、降低了筛选成本；同时提供了一种灵敏度高、成本低的早期检测技术，也为筛选分子机理研究奠定了基础。附图说明图1为本专利技术筛选流程图。图2为本专利技术反筛第三轮qPCR检测结果图。图3为本专利技术反筛第四轮qPCR检测结果图。图中：1，3—HIVP24抗原，2，4—HIVP24抗体。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术进行详细说明，但本专利技术并不局限于具体实施例。实施例一种高效、快速筛选HIVP24抗原核酸适配体的方法，以羧基化琼脂磁珠为介质，进行6轮筛选，选出HIVP24抗原的高特异性核酸适配体，所述6轮筛选是用两轮正筛和四轮反筛筛选得到HIVP24抗原的高特异性核酸适配体，具体包括以下步骤：(1)ssDNA文库的处理；(2)取0.3ml磁珠于1.5mLEP管中，加入300ulHIVP24抗原，37℃，孵育2h，弃去EP管中的抗原，加入500uL封闭液，37℃，1h，结合初级ssDNA文库，37℃，孵育1h；(3)弃去未结合ssDNA文库，用筛选缓冲液洗3次，每次1min，加入200ul去离子水，95℃，10min，收集上清，作为下一轮筛选的次级库；(4)取磁珠0.15mL，加入150uL已稀释100倍的HIVP24抗原，结合次级库，重复步骤(2)的步骤；(5)正筛管：取磁珠0.15mL，加入已稀释100倍的150uLHIVP24抗原，37℃，孵育1h，用筛选缓冲液洗3次，每次1min，然后加入500uL封闭液，37℃，1h；(6)qPCR扩增获得dsDNA：dsDNA反应体系见表4，在上述PCR反应体系中加入80ul模板，充分混匀，每管30ul，分成8管，qPCR进行扩增，S型曲线达到最高点停止扩增；表4dsDNAqPCR反应体系(7)取0.1mL链霉亲和素磁珠于1.5mLEP管中，加入扩增后的dsDNA，37℃，孵育30min，弃取上清液，用500ul的TPBS，37℃水浴，每次4min,重复3次，用水洗1次，加入200uL结合缓冲液，95℃，5min，收集上清液，然后将上清液加入到反筛管中，37℃，孵育45min，将未结合的ssDNA文库再与正筛管于37℃，旋转孵育1h，除去未结合的ssDNA文库；(8)正筛管和反筛管都用筛选缓冲液洗3次，每次3min，各加入200ul去离子水，95℃，5min，收集上清，作为下一轮筛选的次级库；(9)富集效果监测：按照表5所示反应体系添加试剂，充分混匀后，分为4管，每管20ul；取分好的3管体系，各加入10ul正筛管上清、反筛管上清、去离子水，qPCR进行检测；表5集效果监测qPCR反应体系(10)重复上述筛选步骤，在第3轮反筛管磁珠中加入已稀释100倍的150uLHIVgp41抗原，并在每轮筛选中加入tRNA非特异性竞争剂进行筛选，增加筛选的特异性，共进行6轮筛选，各轮SELEX筛选条件见表6；表6各轮SELEX筛选条件此流程利用磁珠法经过6轮筛选成功的获得了HIVP24核心抗原的适配子，从反筛第三轮开始替换反筛管偶联的靶标，目的是为了尽可能多的减少非本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效、快速筛选HIV P24抗原核酸适配体的方法，其特征在于：以羧基化琼脂磁珠为介质，进行6轮筛选，选出HIV P24抗原的高特异性核酸适配体。

【技术特征摘要】
1.一种高效、快速筛选HIVP24抗原核酸适配体的方法，其特征在于：以羧基化琼脂磁珠为介质，进行6轮筛选，选出HIVP24抗原的高特异性核酸适配体。2.根据权利要求1所述的一种高效、快速筛选HIVP24抗原核酸适配体的方法，其特征在于：所述6轮筛选是用两轮正筛和四轮反筛筛选得到HIVP24抗原的高特异性核酸适配体。3.根据权利要求1或2所述的一种高效、快速筛选HIVP24抗原核酸适配体的方法，其特征在于：所述高效、快速筛选HIVP24抗原核酸适配体的方法包括以下步骤：(1)ssDNA文库的处理；(2)取0.3ml磁珠于1.5mLEP管中，加入300ulHIVP24抗原，37℃，孵育2h，弃去EP管中的抗原，加入500uL封闭液，37℃，1h，结合初级ssDNA文库，37℃，孵育1h；(3)弃去未结合ssDNA文库，用筛选缓冲液洗3次，每次1min，加入200ul去离子水，95℃，10min，收集上清，作为下一轮筛选的次级库；(4)取磁珠0.15mL，加入150uL已稀释100倍的HIVP24抗原，结合次级库，重复步骤(2)的步骤；(5)正筛管：取磁珠0.15mL，加入已稀释100倍的150uLHIVP24抗原，37℃，孵育1h，用筛选缓冲液洗3次，每次1min，然后加入500uL封闭液，37℃，1h；(6)qPCR扩增获...

【专利技术属性】
技术研发人员：栗坤，修尘林，
申请(专利权)人：燕山大学，
类型：发明
国别省市：河北;13