一种骨骼肌干细胞的冻存液和冻存方法技术

技术编号:14692382 阅读:163 留言:0更新日期:2017-02-23 15:10
本发明专利技术属于细胞生物学领域,具体涉及一种骨骼肌干细胞的冻存液及冻存方法。本发明专利技术所述骨骼肌干细胞的冻存液,由DMSO、右旋糖酐40和人血白蛋白注射液组成,所述DMSO、右旋糖酐40和人血白蛋白注射液的体积比为1:4:5。本发明专利技术所述骨骼肌干细胞的冻存方法为向骨骼肌干细胞中加入本发明专利技术所述冻存液,混匀后冻存。本发明专利技术所述骨骼肌干细胞冻存液不含有动物源血清,避免了引入污染和过敏原的风险,具有更高的临床安全性。同时,本发明专利技术所述骨骼肌干细胞冻存液能很好保持骨骼肌干细胞的活性。实验表明采用本发明专利技术所述冻存液冻存骨骼肌干细胞,明显提高了骨骼肌干细胞的冻存效果,不管是复苏后的活率还是增殖方面都可以保持较好的状态。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞生物学领域,具体涉及一种骨骼肌干细胞的冻存液及冻存方法。
技术介绍
间充质干细胞是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞,在1966年首先由Friedenstein等从骨髓中发现的。大量研究发现,间充质干细胞不仅可以分化为多种间质组织的细胞,如骨、脂肪、软骨、肌肉、肌腱和韧带等。同时在一定的诱导条件下还可以横向分化为外胚层和内胚层细胞。如上皮细胞、神经元细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞、表皮干细胞等。目前研究表明,间充质干细胞来源十分广泛,除骨髓外,脂肪、脐带华通胶、胎盘、羊膜、肌肉、韧带等均已分离培养出。近年来大量研究证明人体和动物的颅颌面部,特别是牙源性组织中存在具有特殊分化和再生功能的间充质干细胞。近年来因其在组织工程和细胞替代治疗的临床前研究而备受关注。骨骼肌肌源性干细胞(muscle-derivedstemcells,MDSCs)是成年动物或人肌肉组织中特有的干细做为中胚层起源的一种成体间充质干细胞,具有自我更新能力和多项分化的潜能,可在体外分化为血细胞、骨细胞、内皮细胞、神经细胞等系的细胞。骨骼肌干细胞这种功能特性极大地吸引了来自基础医学和临床医学的研究者,给基础科学的研究者们提供了一种研究发展生物学的模式,骨骼肌干细胞所具有的修复、替代和再生能力也为临床医学提供了一个发展新疗法的机会。近几年,干细胞库建立的需要以及临床上对干细胞的需求增加,对干细胞冻存与复苏方面的研究引起了越来越多的关注。与其他来源MSCs一样,MDSCs作为组织工程学研究和潜在临床应用的种子细胞,其过度传代会表现明显衰老或凋亡,且长期体外培养易发生自发分化,失去多分化潜能,增殖、黏附能力下降,细胞凋亡率增加,所以冻存MDSCs也是其研究应用的重要环节之一。细胞冻存液是一种细胞冻存时使用的溶液,它可以供给细胞生命代谢所必须的营养物质,同时可以防止或减少冷冻冰晶对细胞的损伤作用。目前常用的细胞冻存液或市售的细胞冻存液中通常是由二甲基亚砜(dimathylsulfoxide,DMSO)和胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)混合组成。DMSO是一种分子量小,且具有强溶解能力和渗透能力的化学物质。在许多研究中,DMSO是最常用的细胞冻存保护剂,用其保存的细胞复苏后与新鲜细胞比较,具有相似的表型、细胞表面标记及生长速率。DMSO的作用机制是在降温过程中透过细胞膜进入细胞内,降低细胞内、外未结冰溶液中电解质浓度,从而保护细胞免受高浓度电解质损伤,同时细胞内水分不会过度外渗,避免细胞过度脱水皱缩。然而,DMSO对细胞有一定毒性作用,浓度过高会引起较高的渗透压,不利于细胞复苏。因此,目前DMSO常规使用浓度为1%-5%。FBS属于异源性物质,成分复杂,并存在引入污染和过敏原的风险,不适合于临床应用。特别是在细胞治疗中,异源性蛋白的存在,可能会引起不必要的,甚至是未知的不良反应,严重影响治疗结果。
技术实现思路
本专利技术目的在于针对现有技术存在的问题,提供一种临床安全性高,同时又能很好保持冻存细胞活性的细胞冻存液,用于冻存MDSCs。为实现本专利技术的目的,本专利技术采用如下技术方案。一种骨骼肌干细胞的冻存液,由DMSO、右旋糖酐40和人血白蛋白注射液组成,所述DMSO、右旋糖酐40和血白蛋白注射液的体积比为1:4:5。作为优选,所述冻存液中所述人血白蛋白注射液中白蛋白的质量浓度为20%。即25mL人血白蛋白注射液中含5g白蛋白。本专利技术还提供了一种骨骼肌干细胞的冻存方法,向骨骼肌干细胞中加入本专利技术所述冻存液,混匀后冻存。其中,本专利技术所述的冻存方法中所述冻存液的加入量为至骨骼肌干细胞密度为1×106-3×106cells/mL。在一些实施方案中,所述冻存液的加入量为至骨骼肌干细胞密度为1.5×106cells/mL。本专利技术所述的冻存方法中所述冻存优选为放入程序降温盒内-80℃超低温冰箱保存,2-3天后转移到液氮保存。程序降温盒是一个隔层中装有异丙醇的塑料盒,冻存的细胞直接放入盒内,然后细胞即可直接放入-80℃超低温冰箱保存。程序降温盒中的异丙醇在-80℃超低温冰箱里是每10分钟下降1℃,可以很好的保护冻存细胞不会因为温度剧变而受到损害。按照本专利技术,优选的,程序降温盒需预先恢复室温。而冻存的细胞放入程序降温盒内后优选在10min中内转入-80℃超低温冰箱。本专利技术技术人员可以理解,冻存过程中,程序降温盒需提前放入4℃预冷,本专利技术所述优选冻存液现配完成,同时放入4℃预冷。细胞收集完成后用冻存液重悬,分装到冻存管冻存。本领域技术人员可知,本专利技术所述骨骼肌干细胞可以由肌肉组织分离得到。由上述技术方案可知,本专利技术提供了一种骨骼肌干细胞的冻存液及冻存方法。本专利技术所述骨骼肌干细胞的冻存液,由DMSO、右旋糖酐40和人血白蛋白注射液组成,所述DMSO、右旋糖酐40和人血白蛋白注射液的体积比为1:4:5。本专利技术所述骨骼肌干细胞的冻存方法为向骨骼肌干细胞中加入本专利技术所述冻存液,混匀后冻存。本专利技术所述骨骼肌干细胞冻存液不含有动物源血清,避免了引入污染和过敏原的风险,与常规细胞冻存液相比具有更高的临床安全性。同时,本专利技术所述骨骼肌干细胞冻存液能很好保持骨骼肌干细胞的活性。实验表明采用本专利技术所述冻存液冻存骨骼肌干细胞,明显提高了骨骼肌干细胞的冻存效果,不管是复苏后的活率还是增殖方面都可以保持较好的状态,并保持良好的干细胞特性。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示MDSCsP2代细胞形态图,其中图A为40倍,图B为100倍;图2示各实施例冻存复苏后细胞活率比较图;图3示对比例1MDSCs生长曲线;图4示实施例3MDSCs生长曲线;图5示MDSCs形态图,其中图A、C、E、G、I、K、M为对比例1组,图B、D、F、H、J、L、N为实施例3组,图A、B为1d、图C、D为2d、图E、F为3d、图G、H为4d、图I、J为5d、图K、L为6d、图M、N7d;图6示冻存前MDSCs表面marker流式结果图,其中图A为CD73表达情况、图B为HLA-DR表达情况、图C为CD105表达情况、图D为CD34表达情况、图E为CD90表达情况、图F为CD15表达情况;图7示实施例3冻存后MDSCs复苏培养表面marker流式结果图,其中图A为CD73表达情况、图B为HLA-DR表达情况、图C为CD105表达情况、图D为CD34表达情况、图E为CD90表达情况、图F为CD15表达情况;图8示对比例1冻存后MDSCs复苏培养表面marker流式结果图,其中图A为CD73表达情况、图B为HLA-DR表达情况、图C为CD105表达情况、图D为CD34表达情况、图E为CD90表达情况、图F为CD15表达情况。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例,对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本专利技术保护的范围。为了更好的理解本专利技术,下面结合具体实施例对本专利技术进行详细阐述。如无特殊说明本专利技术实施例所涉及的试剂均为市本文档来自技高网
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一种<a href="http://www.xjishu.com/zhuanli/01/201610877344.html" title="一种骨骼肌干细胞的冻存液和冻存方法原文来自X技术">骨骼肌干细胞的冻存液和冻存方法</a>

【技术保护点】
一种骨骼肌干细胞的冻存液,由DMSO、右旋糖酐40和人血白蛋白注射液组成,所述DMSO、右旋糖酐40和人血白蛋白注射液的体积比为1:4:5。

【技术特征摘要】
1.一种骨骼肌干细胞的冻存液,由DMSO、右旋糖酐40和人血白蛋白注射液组成,所述DMSO、右旋糖酐40和人血白蛋白注射液的体积比为1:4:5。2.根据权利要求1所述的冻存液,其特征在于,所述人血白蛋白注射液中白蛋白的质量浓度为20%。3.一种骨骼肌干细胞的冻存方法,向骨骼肌干细胞中加入权利要求1所述冻存液,混匀后冻存。4.根据权利要求3所述的冻...

【专利技术属性】
技术研发人员:陈海佳王一飞葛啸虎戚康艺张维敏
申请(专利权)人:广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
类型:发明
国别省市:广东;44

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