人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法技术

本发明专利技术涉及一种人精原干细胞体外分化为功能精子的三维诱导方法，属于生物工程领域。该方法在获得人精原干细胞的基础上，通过Matrigel构建了三维培养体系，添加诱导分化的关键因子，对精原干细胞进行体外诱导分化，获得了具有受精能力的精子细胞，并通过免疫细胞化学法鉴定诱导获得的精子细胞，通过荧光原位杂交技术（FISH）检测诱导获得的精子细胞染色体数目，通过圆形精子显微注射法（ROSI）检测诱导获得的精子细胞的受精与发育能力，本申请不仅为研究人类精子发生的分子机理提供优良的模型，并且，可以为无精症病人提供功能配子，将使男性不育患者拥有自己遗传背景的孩子。

【技术实现步骤摘要】

人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法。
技术介绍
目前，全世界约有15%育龄夫妇不孕不育，其中男性因素占50%；研究表明，欧洲20%男性不育患者属于无精子症。无精子症在中国男性不育患者中高达25%。而且，因为“晚婚晚育”等社会问题，这一疾病正逐年加剧。因此在体外获得有受精能力的生殖细胞一直是生殖生物学和生殖医学领域的难题和热点。精子发生（Spermatogenesis）是指精原干细胞（Spermatogonialstemcells，SSCs）自我更新并分化为成熟精子细胞的过程。很多无精症患者有精原干细胞，但由于体内睾丸微环境的缺失或破坏，导致无法获得功能性精子。因此，如果能将精原干细胞体外诱导分化成有功能的精子，可为无精症病人提供种子细胞，治疗男性不育，使男性不育患者拥有自己孩子的梦想得以实现。然而，目前尚未有从精原干细胞体外诱导分化为精子的相关报道。Sousa等将分离获得的非梗阻性无精子症（NonobstructiveAzoospermic，NOA）病人生殖细胞和体细胞（包括精原干细胞、精母细胞和支持细胞），在肾细胞（Vero细胞）条件培养基中添加促卵泡素（folliclestimulatinghormone，FSH）、睾酮，培养2-3周后，检测到6.9%细胞进入减数分裂，22.7%细胞发育至精子细胞；将获得的圆形精子注射到卵母细胞（ROSI），胚胎受精率为37.5%，囊胚率28.6%。Yang等诱导隐睾病人的精原干细胞体外分化为有受精和发育潜能的精子细胞，但是其起始细胞包含有少量精母细胞，且分化效率比较低。目前的研究方法起始细胞纯度不够，不是单一的精原干细胞，不能明确表明是精子是从精原干细胞分化而来。Ribooldi等将非梗阻型无精子症（NOA）病人睾丸细胞中CD49F-阳性细胞与睾丸支持细胞共培养5天后检测到单倍体细胞，但是，CD49F不是特异的人精原干细胞表面标记物，人支持细胞也表达CD49F。并且，其存在以下不足：第一，由于CD49F不是特异的人精原干细胞表面标记物，起始细胞纯度不够；第二，只是检测到了精子，没有明确诱导效率；第三，没有进行功能检测，不能确定诱导获得精子细胞是否具有功能。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，而提供一种人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法，该方法对精原干细胞进行体外诱导，获得了具有受精能力的精子细胞。本专利技术采用如下技术方案：人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法，包括如下步骤：1)称取睾丸组织置于DMEM/F12中，剪成组织小块，用DMEM/F12清洗，除去残留的血细胞；2）将步骤1）所得睾丸组织剪至半液态，添加DMEM/F12，将睾丸组织转移到容器内；3）向步骤2）的睾丸组织中加入酶消化液Ⅰ，置于水浴摇床中进行孵育；4）镜检，确保所有组织块均已消化成单个生精小管，将含有生精小管的消化液转移至另一新的离心管中，加入新鲜的DMEM/F12和10%FBS终止消化；5）静置，移除上清液，加入新鲜的DMEM/F12，充分清洗生精小管，重复操作数次；6）向步骤5）得到的生精小管中加入酶消化液Ⅱ；7）将步骤6）中的混合液转移至另一新的离心管中，置于水浴摇床中进行孵育；8）消化后，用移液管轻轻吹打数次，镜检，确保生精小管全部消化为单个细胞；9）加入新鲜DMEM/F12和10%FBS终止消化，静置10min，收集上清液进行离心；10）弃上清液，加入DMEM/F12重悬细胞，静置，收集上清液进行离心；11）弃上清液，加入新鲜的DMEM/F12重悬细胞，滤网过滤，除去细胞团；12）将步骤11）得到的细胞悬液进行离心，弃上清液，加入新鲜DMEM/F12；13）将步骤12）得到的细胞悬液进行培养，分离生殖细胞和支持细胞；14）将步骤13）中分离的生殖细胞经磁珠激活细胞分选术（MACS）分离获得GPR125-阳性精原干细胞；15)将步骤14）中分离的GPR125-阳性精原干细胞与丝裂霉素处理过的人支持细胞用DMEM/F12悬浮后，按1：3的比例混合，将混合细胞和Matrigel混合均匀，放入12孔培养板中；16）将步骤15）中铺好细胞的12孔板放入培养箱孵育，待Matrigel胶凝固后，缓慢加入诱导培养基，培养箱培养，每天更换新的诱导培养基；17）诱导20天后，采用流式细胞术（FACS）分离得到单倍体精子细胞。进一步，所述的人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法，包括如下步骤：1)称取0.8~1.5g睾丸组织置于10mLDMEM/F12中，剪成体积约3×3×3mm3组织小块，用DMEM/F12清洗3次，除去残留的血细胞；2）用剪刀将睾丸组织剪至半液态，添加20mLDMEM/F12，然后将组织转移到120mL容器内；3）向步骤2）的睾丸组织中加入酶消化液Ⅰ，置于34℃水浴摇床中，孵育10~15min；4）镜检，确保所有组织块均已消化成单个生精小管，将含有生精小管的消化液转移至另一新的50mL离心管，加入30mL新鲜的DMEM/F12终止消化；5）静置5min，用25mL玻璃移液管移除上清液，加入50mL新鲜的DMEM/F12充分清洗生精小管，重复操作3次；6）向步骤5）得到的生精小管中加入酶消化液Ⅱ；7）将步骤6）中的混合液用10mL玻璃移液管转移至另一新的离心管中，置于34℃水浴摇床，孵育15min；8）消化后，用10mL玻璃移液管轻轻吹打10~15次，镜检，确保生精小管全部消化为单个细胞；9）加入30mL新鲜的DMEM/F12和10%FBS终止消化，静置10min，收集上清液，用1000rpm离心5min；10）弃上清液，加入50mLDMEM/F12重悬细胞，静置10min，收集上清液，1000rpm离心5min；11）弃上清液，加入适量新鲜DMEM/F12重悬细胞，用40µm尼龙网过滤，除去细胞团；12）将步骤11）得到的细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清液，加入新鲜DMEM/F12；13）将0.1%明胶3mL加入到25cm2的培养瓶中，34°C培养箱孵育1小时，去掉明胶后，将步骤12）得到的细胞悬液加入培养瓶中培养3小时后，分离生殖细胞和支持细胞；14）将步骤13）中分离的生殖细胞经免疫磁珠激活细胞分选术分离GPR125-阳性精原干细胞；15)将10ng/mL丝裂霉素加入生长密度为80%的人支持细胞上，34°C培养箱孵育2小时，PBS清洗6次后，用0.25%胰酶消化3min，加入10%FBS的DMEM/F12终止，1000rpm离心5min，弃上清液，收集丝裂霉素处理的支持细胞。16)将步骤14）中分离的GPR125-阳性精原干细胞与步骤15）收集的丝裂霉素处理过的人支持细胞用DMEM/F12悬浮后，按1:3比例混合，0.4mL106个混合细胞和0.4mLMatrigel于冰上混合均匀，然后放入12孔板中；17）将步骤16）中接种好细胞的12孔培养板放入34°C培养箱孵育1小时，待Matrigel胶凝固后，缓慢加入1mL诱导培养基，34°C培养箱培养，每天更换新的诱导培养基；18）诱导20天后，采用流式细胞术分离得到单倍体精子细胞。其中，步骤3）中所述的酶溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：1)称取人类睾丸组织置于DMEM/F12中，剪成组织小块，用DMEM/F12清洗，除去残留的血细胞；2）将步骤1）所得睾丸组织剪至半液态，添加DMEM/F12，将睾丸组织转移到容器内；3）向步骤2）的睾丸组织中加入酶消化液Ⅰ，置于34°C水浴摇床中进行孵育；4）镜检，确保所有组织块均已消化成单个生精小管，将含有生精小管的消化液转移至另一新的离心管中，加入新鲜的DMEM/F12和10% 胎牛血清（FBS）终止消化；5）静置，移除上清液，加入新鲜的DMEM/F12，充分清洗生精小管，重复操作数次；6）向步骤5）得到的生精小管中加入酶消化液Ⅱ；7）将步骤6）中的混合液转移至另一新的离心管中，置于34°C水浴摇床中进行孵育；8）消化后，用玻璃移液管轻轻吹打数次，镜检，确保生精小管全部消化为单个细胞；9）加入新鲜DMEM/F12和10% FBS终止消化，静置10min，收集上清液进行离心；10）离心后，弃上清液，加入DMEM/F12重悬细胞，静置，收集上清液进行离心；11）离心后，弃上清液，加入新鲜的DMEM/F12重悬细胞，滤网过滤，除去细胞团；12）将步骤11）得到的细胞悬液进行离心，弃上清液，加入新鲜DMEM/F12；13）将步骤12）得到的细胞悬液用DMEM/F12和10% FBS培养，分离生殖细胞和支持细胞；14）将步骤13）中分离的生殖细胞经免疫磁珠激活细胞分选术（MACS）分离获得GPR125‑阳性精原干细胞；15) 将步骤14）中分离的GPR125‑阳性精原干细胞与丝裂霉素处理过的人支持细胞用DMEM/F12悬浮后，按1：3的比例混合，将混合细胞和Matrigel混合均匀，放入12孔培养板中；16）将步骤15）中铺好细胞的12孔培养板放入培养箱孵育，待Matrigel胶凝固后，缓慢加入诱导培养基，培养箱34°C培养，每天更换新的诱导培养基；17）诱导20天后，采用流式细胞术（FACS）分离得到单倍体精子细胞。...

【技术特征摘要】
1.人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：1)称取人类睾丸组织置于DMEM/F12中，剪成组织小块，用DMEM/F12清洗，除去残留的血细胞；2）将步骤1）所得睾丸组织剪至半液态，添加DMEM/F12，将睾丸组织转移到容器内；3）向步骤2）的睾丸组织中加入酶消化液Ⅰ，置于34°C水浴摇床中进行孵育；4）镜检，确保所有组织块均已消化成单个生精小管，将含有生精小管的消化液转移至另一新的离心管中，加入新鲜的DMEM/F12和10%胎牛血清（FBS）终止消化；5）静置，移除上清液，加入新鲜的DMEM/F12，充分清洗生精小管，重复操作数次；6）向步骤5）得到的生精小管中加入酶消化液Ⅱ；7）将步骤6）中的混合液转移至另一新的离心管中，置于34°C水浴摇床中进行孵育；8）消化后，用玻璃移液管轻轻吹打数次，镜检，确保生精小管全部消化为单个细胞；9）加入新鲜DMEM/F12和10%FBS终止消化，静置10min，收集上清液进行离心；10）离心后，弃上清液，加入DMEM/F12重悬细胞，静置，收集上清液进行离心；11）离心后，弃上清液，加入新鲜的DMEM/F12重悬细胞，滤网过滤，除去细胞团；12）将步骤11）得到的细胞悬液进行离心，弃上清液，加入新鲜DMEM/F12；13）将步骤12）得到的细胞悬液用DMEM/F12和10%FBS培养，分离生殖细胞和支持细胞；14）将步骤13）中分离的生殖细胞经免疫磁珠激活细胞分选术（MACS）分离获得GPR125-阳性精原干细胞；15)将步骤14）中分离的GPR125-阳性精原干细胞与丝裂霉素处理过的人支持细胞用DMEM/F12悬浮后，按1：3的比例混合，将混合细胞和Matrigel混合均匀，放入12孔培养板中；16）将步骤15）中铺好细胞的12孔培养板放入培养箱孵育，待Matrigel胶凝固后，缓慢加入诱导培养基，培养箱34°C培养，每天更换新的诱导培养基；17）诱导20天后，采用流式细胞术（FACS）分离得到单倍体精子细胞。2.根据权利要求1所述的人精原干细胞体外分化为功能精子的三维诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：1)称取0.8~1.5g睾丸组织置于10mLDMEM/F12中，剪成体积约3×3×3mm3组织小块，用DMEM/F12清洗3次，除去残留的血细胞；2）用剪刀将睾丸组织剪至半液态，添加20mLDMEM/F12，然后将组织转移到120mL容器内；3）向步骤2）的睾丸组织中加入酶消化液Ⅰ，置于34℃水浴摇床中，孵育10~15min；4）镜检，确保所有组织块均已消化成单个生精小管，将含有生精小管的消化液转移至另一新的50mL离心管，加入30mL新鲜的DMEM/F12终止消化；5）静置5min，用25mL玻璃移液管移除上清液，加入50mL新鲜的DMEM/F12充分清洗生精小管，重复操作3次；6）向步骤5）得到的生精小管中加入酶消化液Ⅱ；7）将步骤6）中的混合液用10mL玻璃移液管转移至另一新的离心管中，置于34℃水浴摇床，孵育15min；8）消化后，用10mL玻璃移液管轻轻吹打10~15次，镜检，确保生精小管全部消化为单个细胞；9）加入30mL新鲜的DMEM/F12和10%FBS终止消化，静置10min，收集上清液，用1000rpm离心5min；10）弃上清液，加入50mLDMEM/F12重悬细胞，静置10min，收集上清液，1000rpm离心5min；11）弃上清液，加入适量新鲜DMEM/F12重悬细胞，用40µm尼龙网过滤，除去细胞团；12）将步骤11）得到的细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清液，加入新鲜DMEM/F12；13）将0.1%明胶3mL加入到25cm2的培养瓶中，34°C培养箱孵育1小时，去掉明胶后，将步骤12）得到的细胞悬液加入培养瓶中培养3小时后，分离生殖细胞和支持细胞；14）将步骤13）中分离的生殖细胞经免疫磁珠激活细胞分选术分离GPR125-阳性精原干细胞；15)将10ng/mL丝裂霉素加入生长密度为80%的人支持细胞上，34°C培养箱孵育2小时，PBS清洗6次后，用0.25%胰酶消化3min，加入10%FBS的DMEM/F12终止，1000rpm离心5min，弃上清液，收集丝裂霉素处理的支持细胞；16)将步骤14）中分离的GPR125-阳性精原干细胞与步骤15）收集的丝裂霉素处理过的人支持细胞用DMEM/F12悬浮后，按1:3比例混合，0.4mL106个混合细胞和0.4mLMatrigel于冰上混合均匀，然后放入12孔板中；17）将步骤16）中接种好细胞的12孔培养板放入34°C培养箱孵育1小时，待Matrigel胶凝固后，缓慢加入1mL诱导培养基，34°C培养箱培养，每天更换新的诱导培养基；18）诱导20天后，采用流式细胞术分离得到单倍体精子细胞。3.根据权利要求1所述的人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法，其特征在于，步骤3）中所述的酶溶液Ⅰ由终浓度为2mg/mL的胶原酶溶液和1µg/µl的DNaseⅠ组成，配制后过滤除菌，其中所述胶原酶为IV型胶原酶。4.根据权利要求1所述的人精原干细胞体外分化为功能精子细胞的三维诱导方法，其特征在于，步骤6）中...

【专利技术属性】
技术研发人员：何祖平，孙敏，袁青青，牛明辉，王洪，文丽平，付红勇，周帆，李铮，
申请(专利权)人：何祖平，
类型：发明
国别省市：上海;31