一种检测跨膜蛋白单克隆抗体亲和力的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测跨膜蛋白单克隆抗体亲和力的方法，主要包括以下步骤：1)构建膜蛋白高表达的稳定细胞株，确保FACS实验中，阳性结合峰有最大的右移；2)荧光素标记抗体；3)饱和性结合实验；4)竞争性结合实验；5)数据处理。本发明专利技术可以有效测定跨膜蛋白单克隆抗体的亲和力，而且避免了使用放射性同位素，具有安全、灵敏度高、重复性好、检测结果稳定可靠等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抗体亲和力的检测方法，特别涉及一种检测跨膜蛋白单克隆抗体亲和力的方法。
技术介绍
抗体亲和力是确定抗体性质的重要参数之一，它表示抗体结合位点和和抗原表位之间的结合牢固程度，常用解离平衡常数KD表示，指达到平衡后，结合半数抗原分子时所需抗体的浓度。抗体与抗原结合的亲和力可为选用不同用途的单抗提供依据，高亲和力的抗体对于定量检测、诊断及疾病的靶向治疗是有用的，它可以提高阳性检出率或提高治疗性抗体的药效；而亲和力相当的抗体用于亲和纯化，亲和力过低不易吸附，过高又不易洗脱。因此，要根据应用的目的选择不同亲和力的抗体，就需要先对抗体亲和力进行检测。目前对于抗体亲和力的检测一般采用平衡透析法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、生物传感器法(SPR)、平衡剔除免疫测量法(KinExA)和放射免疫分析(RIA)等。平衡透析法的全部抗原抗体反应过程在均一液相体系中完成，反应的动力学过程受到的干扰因素较少，符合质量作用定律的前提条件，但该法仅能测定小分子抗原与相应抗体间的亲和常数。理论上采用非竞争性ELISA法测定抗体亲和常数还不十分完善，影响反应因素较多。生物传感器法(Katsambaetal.,2006,AnalyticalBiochemistry364:67-77)和平衡剔除免疫测量法(Drakeetal.,2004,Anal.Biochem.2004；328:35–43)，既可以测定抗体的亲和力，也可以测定抗原抗体结合的动力学特征，但该法受仪器条件的限制，价格昂贵。测定跨膜蛋白的单克隆抗体亲和力，如单次跨膜蛋白，可以表达可溶性胞外区作为抗原来测定与对应抗体的亲和力。但对于多次跨膜蛋白，如GPCR或者离子通道蛋白，没有天然构象的可溶性胞外区或很少有天然构象的可溶性表达的多次跨膜蛋白作为抗原，采用生物传感器法测定抗体和表达膜蛋白抗原的细胞之间的亲和力常数也不成熟。而放射免疫分析抗体和跨膜蛋白之间亲和力，要求将抗体进行放射性标记，反应完成后，又需将抗原抗体复合物与游离的抗原、抗体分开，实验过程繁琐、复杂，不易广泛开展，虽然RIA灵敏度高，但会造成放射性污染和危害，且存在常用放射性核素半衰期短、无法自动化分析等诸多不足。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测跨膜蛋白单克隆抗体亲和力的方法，可以有效测定跨膜蛋白单克隆抗体的亲和力，而且避免了使用放射性同位素，具有安全、灵敏度高、重复性好、检测结果稳定可靠等优点。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种检测跨膜蛋白单克隆抗体亲和力的方法，包括以下步骤：(1)构建膜蛋白高表达的稳定细胞株；(2)荧光素标记抗体；(3)饱和性结合实验，获得表观结合常数KD；(4)竞争性结合实验，得出竞争实验中的半抑制浓度IC50值；(5)数据处理：根据公式Ki＝IC50/(1+([L]/KD))计算出竞争性抗体的Ki值，计算出抗体的竞争性Ki值，采用竞争性亲和力常数Ki代表待测抗体与膜蛋白抗原之间的亲和力大小，其中[L]代表竞争性结合实验中固定的标记抗体的浓度。本专利技术首先，通过荧光标记抗体，进行饱和性结合实验，测定标记探针的表观亲和力。由于经过荧光标记反应，抗体被部分修饰，失活，使得抗体的表观亲和力会偏大，一般都会10倍于实际的抗体亲和力。然后，通过非标记的抗体竞争荧光标记的抗体，进行竞争性结合实验，计算出半抑制浓度IC50。最后，根据公式：Ki＝IC50/(1+([L]/KD))，其中[L]代表竞争实验中标记抗体的浓度，计算出抗体的竞争性Ki值，采用竞争性亲和力常数Ki代表待测抗体与膜蛋白抗原之间的亲和力大小。利用所述检测抗体亲和力的方法可以有效测定跨膜蛋白单克隆抗体的亲和力，而且避免了使用放射性同位素，具有安全、灵敏度高、重复性好、检测结果稳定可靠等优点。作为优选，步骤(1)构建膜蛋白高表达的稳定细胞株具体为：接种CHO-DHFR-细胞至细胞培养板中，培养后转染带有hETAR基因的载体(市售)，获得CHO-DHFR-hETAR细胞，然后50nM至10μMMTX加压筛选，构建的稳定细胞株分别进行FACS检测，利用多克隆ETAR抗体(Abcam，市售)鉴定加压后的细胞群体，筛选后的CHO-DHFR-hETAR细胞膜上hETAR有大量表达，最后经过亚克隆、鉴定获得hETAR高表达稳定细胞株。作为优选，步骤(2)荧光素标记抗体具体为：PBS稀释纯化后的抗体(80H4)至2mg/ml得抗体液，取抗体液与荧光染料混匀，混合摩尔比例为：抗体:荧光染料＝1:7.5，室温旋转孵育1h得荧光素标记抗体。作为优选，步骤(3)饱和性结合实验具体为：用含10mMEDTA的PBS收集上述CHO-DHFR-ETAR细胞和阴性对照CHO-DHFR细胞，离心后弃上清，用流式上样缓冲液重悬，分至V型96孔板，1×105个细胞/孔，加入不同浓度梯度(316.46,100.14,31.69,10.03,3.17,1.00nM)荧光素标记抗体，每个浓度2复孔，冰上孵育1h，离心，弃上清，用流式上样缓冲液洗一次，再离心，最后用流式上样缓冲液重悬，上机检测，计算每孔染色细胞的平均荧光强度。作为优选，表观结合常数KD获得方法如下：采用Prism5软件计算饱和性结合实验数据：在X列输入一系列荧光标记抗体浓度，在A列输入总结合对应的平均荧光强度值，在B列输入非特异性结合对应的平均荧光强度值，再选择结合-饱和性实验分析模式，选择单结合位点-总结合/非特异性结合分析模块进行拟合，得出表观结合常数KD。作为优选，步骤(4)竞争性结合实验具体为：用含10mMEDTA的PBS收集CHO-DHFR-ETAR和阴性对照CHO-DHFR细胞，离心后弃上清，用流式上样缓冲液重悬，分至V型96孔板，1×105/孔；另一块96孔加样板中，加入不同浓度梯度(316.00,100.00,31.65,10.01,3.17,1.00,0.32,0.10,0.03,0.01nM)的无荧光素标记抗体以及固定浓度(100nM)的荧光素标记抗体，每个浓度2复孔，预先混匀，再一起加至V型96孔板中，冰上孵育1h，离心，弃上清，用流式上样缓冲液洗一次，再离心，最后用流式上样缓冲液重悬，上机检测，计算每孔染色细胞的平均荧光强度。作为优选，半抑制浓度IC50值获得方法如下：采用Prism5软件计算竞争性结合实验数据：在X列输入一系列无荧光素标记抗体浓度，在A列输入相应非标记抗体竞争标记抗体结合ETAR细胞的平均荧光强度值，再将X列的浓度值转换成Log值，然后选择结合-竞争实验分析模式，选择单结合位点-拟合LogIC50模块进行拟合，得出竞争性结合实验中的半抑制浓度IC50值。作为优选，固定浓度的荧光素标记抗体的浓度为100nM。作为优选，不同浓度梯度的无荧光素标记抗体浓度范围为0.01～316nM。本专利技术的有益效果是：可以有效测定跨膜蛋白单克隆抗体的亲和力，而且避免了使用放射性同位素，具有安全、灵敏度高、重复性好、检测结果稳定可靠等优点。附图说明图1是源于表1数据，由Prism5软件调取平均荧光强度对Dylight488标记的80H4抗体浓度，进行饱和性结合作图结果。图2是源于表3数据，由Prism5软件调取最大结合百分率对Dylight4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测跨膜蛋白单克隆抗体亲和力的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建膜蛋白高表达的稳定细胞株；(2)荧光素标记抗体；(3)饱和性结合实验，获得表观结合常数KD；(4)竞争性结合实验，得出竞争实验中的半抑制浓度IC50值；(5)数据处理：根据公式Ki＝IC50/(1+([L]/KD))计算出竞争性抗体的Ki值，计算出抗体的竞争性Ki值，采用竞争性亲和力常数Ki代表待测抗体与膜蛋白抗原之间的亲和力大小，其中[L]代表竞争性结合实验中固定的标记抗体的浓度。

【技术特征摘要】
1.一种检测跨膜蛋白单克隆抗体亲和力的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建膜蛋白高表达的稳定细胞株；(2)荧光素标记抗体；(3)饱和性结合实验，获得表观结合常数KD；(4)竞争性结合实验，得出竞争实验中的半抑制浓度IC50值；(5)数据处理：根据公式Ki＝IC50/(1+([L]/KD))计算出竞争性抗体的Ki值，计算出抗体的竞争性Ki值，采用竞争性亲和力常数Ki代表待测抗体与膜蛋白抗原之间的亲和力大小，其中[L]代表竞争性结合实验中固定的标记抗体的浓度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)构建膜蛋白高表达的稳定细胞株具体为：接种CHO-DHFR-细胞至细胞培养板中，培养后转染带有hETAR基因的载体，获得CHO-DHFR-hETAR细胞，然后50nM至10μMMTX加压筛选，构建的稳定细胞株分别进行FACS检测，利用多克隆ETAR抗体鉴定加压后的细胞群体，筛选后的CHO-DHFR-hETAR细胞膜上hETAR有大量表达，最后经过亚克隆、鉴定获得hETAR高表达稳定细胞株。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)荧光素标记抗体具体为：PBS稀释纯化后的抗体至2mg/ml得抗体液，取抗体液与荧光染料混匀，混合摩尔比例为：抗体:荧光染料＝1:7.5，室温旋转孵育1h得荧光素标记抗体。4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：步骤(3)饱和性结合实验具体为：用含10mMEDTA的PBS收集上述CHO-DHFR-ETAR细胞和阴性对照CHO-DHFR细胞，离心后弃上清，用流式上样缓冲液重悬，分至V型96孔板，1×105个细胞/孔，加入不同浓度梯度荧光素标记抗体，每个浓度2复孔，冰上孵育1h，离心，弃上清，用流式上样缓冲液洗一次，再离...

【专利技术属性】
技术研发人员：景书谦，汪笑峰，张成，
申请(专利权)人：杭州鸿运华宁生物医药工程有限公司，北京师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33