蛋白质的选择性还原制造技术

本发明专利技术提供一种制备脱封端的半胱氨酸蛋白质制剂的方法，包括脱封端的工程化的半胱氨酸抗体制剂。所述方法包括，其中，将还原试剂与工程化的半胱氨酸抗体分子接触，每个抗体分子具有至少一个封端的工程化的半胱氨酸残基和至少一个链间二硫键，以及将还原试剂与抗体分子在足以脱封端工程化的半胱氨酸残基并形成封端副产物的条件下反应。所述方法还包括在还原反应过程中移除封端副产物。基本上所有还原前存在于抗体分子中的链间二硫键在还原反应后被保留。还描述了抗体偶联物以及采用脱封端的抗体制剂来制备抗体偶联物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2014年2月11日提交的美国专利申请号61/938,378的优先权，其内容通过引用全文纳入本文。专利技术背景选定的氨基酸被突变成半胱氨酸Cys的单克隆抗体(例如工程化的半胱氨酸mAbs，即ecmAbs)特别适合用于偶联物(例如抗体药物偶联物(ADCs))，因为这些由其衍生的偶联物具有有利的特性，其中包括同质性、有利的药物动力学、稳定性和溶解性。这些半胱氨酸突变被置于在抗体氨基酸序列中的某些位置，这些位置通常不会形成链间或者链内的二硫键，并且在细胞内产生突变mAb的表达机制会将半胱氨酸残基作为未配对的半胱氨酸进行处理。因此，工程化半胱氨酸，通常会用非编码的半胱氨酸分子以混合的二硫键产物形式表达(例如，工程化半胱氨酸通常用封端剂(例如半胱氨酸、半胱氨酰甘氨酸、谷胱甘肽)进行“封端(capped)”)。因此，为了从ecmAbs出发制备偶联物(例如ADC)，通常需要将ecmAb置于还原条件下，从而将工程化半胱氨酸从混合的二硫键产物转化为自由巯基，通常这一“脱封端”或者“活化”伴随着ecmAb链间二硫键的还原。尽管链间二硫键可以通过温和氧化重新形成，但是这种再氧化步骤增加了ADC制备过程中复杂性和费用。选择性还原方法是难以实现的，因为已证明难以还原工程化半胱氨酸残基的同时而不还原链间二硫键。因此，需要开发用于对工程化半胱氨酸残基的进行脱封端的选择性还原方法。本专利技术解决了这个和其它需求。专利技术概述在本专利技术中，提供了一种选择性还原工程化的半胱氨酸抗体的方法。这种方法包括：将一还原剂与工程化的半胱氨酸抗体分子接触，每个抗体分子含有至少一个封端的工程化的半胱氨酸残基和至少一个链间二硫键，以及将还原剂与抗体分子在足以使工程化的半胱氨酸残基“脱封端”并且形成封端副产物的条件下进行反应。封端副产物在还原反应的过程中被移去。这种方法导致形成脱封端的工程化半胱氨酸抗体制剂。这种脱封端的工程化半胱氨酸抗体制剂可以包含封端的和脱封端的工程化半胱氨酸抗体。还原反应前存在于抗体分子中基本上所有的链间二硫键，在脱封端的工程化半胱氨酸抗体制剂中仍然保留。所述方法可以进一步包括以下步骤：在移除封端副产物时，向还原反应补充额外的还原剂。在还原反应过程中从反应混合物中移除封端副产物，可以通过例如透析或渗滤进行。在优选的实施方式中，在还原反应混合物中，封端副产物浓度被维持低于如下浓度：在该浓度下，再封端阻止了工程化半胱氨酸残基被进一步活化。在某些方面，所述方法提供一种非封端的工程化半胱氨酸抗体制剂。典型地，在抗体制剂中至少60％的工程化的半胱氨酸是非封端工程化的半胱氨酸残基。在某些方面，在抗体制剂中至少70％，至少75％或者至少80％的工程化的半胱氨酸残基是非封端工程化的半胱氨酸残基。在某些方面，采用本专利技术方法，在抗体分子中至少85％的还原反应前就存在的链间二硫键在脱封端工程化的半胱氨酸抗体制剂中仍然保留。在某些方面，选择还原剂和还原条件，使得不超过20％，不超过15％，不超过10％或者不超过5％的抗体分子中存在的链间二硫键，在还原反应过程中被转化成一对自由巯基。在相关方面，这个专利技术提供抗体偶联物，包括抗体药物偶联物，和采用脱封端抗体制备抗体偶联物的方法。在制备抗体药物偶联物之前，抗体制剂中残留的还原剂被移除。本专利技术还提供一种选择性还原含有非配对半胱氨酸残基的非抗体蛋白质的方法。这种方法包括：将一还原剂与蛋白质分子接触，每个蛋白质分子含有至少一个封端的工程化的半胱氨酸残基和至少一个链间二硫键，以及将还原剂与蛋白质分子在足以使半胱氨酸残基“脱封端”并形成封端副产物的条件下进行反应。封端副产物在还原反应的过程中被移去。所述方法导致形成脱封端的半胱氨酸蛋白质制剂。这种脱封端的半胱氨酸蛋白质制剂可以包含封端和脱封端的半胱氨酸残基的蛋白质分子。蛋白质分子中在还原反应前就存在的基本上所有的链间二硫键，在脱封端的半胱氨酸蛋白质制剂中仍然保留。这种方法可以进一步包括以下步骤：在移除封端副产物时，向还原反应补充额外的还原剂。在还原反应过程中从反应混合物中移除封端副产物可以通过例如透析或渗滤进行。在优选的实施方式中，在还原反应混合物中，封端副产物浓度被维持低于如下浓度：在该浓度下，再封端阻止了工程化半胱氨酸残基被进一步活化。所述方法提供一种非封端的半胱氨酸蛋白质制剂。典型地，采用所述方法，至少60％的半胱氨酸是脱封端(或者，换言之，是活化的)。在某些方面，采用所述方法，至少70％，至少75％或者至少80％的封端的半胱氨酸残基是被脱封端的。在某些方面，采用本专利技术方法，蛋白质分子中至少85％的还原反应前就存在的链间二硫键，在脱封端工程化的半胱氨酸抗体制剂中仍然保留。在某些方面，选择还原剂和还原条件，使得不超过20％，不超过15％，不超过10％或者不超过5％的蛋白质分子中存在的链间二硫键，在还原反应过程中被转化成一对自由巯基。附图说明图1显示了用三种不同的单巯基还原剂(半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸(NAC)和半胱胺)，在相同的条件下(低浓度2mM)处理一种ecmAb(溶液浓度99μM)，对所得的样品进行rPLRP柱分析的结果。Y轴代表可用的总工程化的半胱氨酸的活化百分比。没有一种还原剂能够达到对可用的工程化的半胱氨酸残基的100％激活。没有证据表明，在这些实验中，链间二硫键被还原。图2显示了一种S239CecmAbmcMMAFADC的重链的rPLRP柱分析结果。S239CecmAb用本专利技术中的方法选择性地还原，并且偶联到mcMMAF药物接头。还原剂是0.8mM半胱氨酸。工程化的半胱氨酸残基的活化基本上进行到完成。标注为％H0的柱表示没有与药物接头偶联的重链。标注为％H1的柱表示偶联有1个药物接头的重链；而标注为％H2的柱表示偶联有2个药物-接头的重链。图3显示了S239CecmAbmcMMAFADC重链的rPLRP柱分析结果。S239CecmAb用本专利技术中的方法选择性地还原，并且偶联到mcMMAF药物-接头上。还原剂是0.55mM半胱氨酸。只有小百分比的工程化的半胱氨酸残基保持封端(％H0)，而未封端工程化的半胱氨酸残基的百分比接近100％(％H1)，而且非特异性还原(％H2)的量保持在低位。图4显示了通过S239CecmAbs选择性实现了工程化的半胱氨酸的活化，该活化与重链和轻链可变区的种类无关。mAb1是人源化2H12ecMAb，mAb2是人源化的h1F6ecMab(活化:％H0；选择性:％H2)。对于两种mAbs而言，脱封端速率是类似的。工程化半胱氨酸残基的选择性活化，在mAb1的三个变异位点S239,K326和A327上得到证明。这些结果表明，工程化半胱氨酸的活化可以在不同位点选择性地实现。这些实验中采用约0.9mM的半胱氨酸。图5显示了mAb1的S239C突变体的工程化的半胱氨酸的活化。反应混合物中mAb的浓度与图4反应中类似，但是半胱氨酸的浓度更低一些，在整个时间进程中大约为0.5mM。这个实验显示，采取低浓度的半胱氨酸可获得最大选择性，并且在给予足够时间的情况下，可以以非常高的选择性实现完全活化。这次实验最终时间点所制备得到的偶联物的平均载药量是1.93，这与标称值2.0很接近，并且落在通过传统非选择性还原然后再氧化所得本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种选择性还原蛋白质的方法，所述方法包括：a)将还原剂与蛋白质分子接触，每个蛋白质分子具有至少一个封端的半胱氨酸残基和至少一个链间二硫键；b)将还原剂和蛋白质分子在足以使半胱氨酸残基脱封端并且形成封端副产物的条件下进行反应；以及c)在反应过程中移除封端副产物；由此形成脱封端的半胱氨酸蛋白质制剂，并且基本上所有在还原反应前存在于蛋白质分子的链间二硫键，在脱封端的半胱氨酸蛋白制剂中被保留。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.11 US 61/938,3781.一种选择性还原蛋白质的方法，所述方法包括：a)将还原剂与蛋白质分子接触，每个蛋白质分子具有至少一个封端的半胱氨酸残基和至少一个链间二硫键；b)将还原剂和蛋白质分子在足以使半胱氨酸残基脱封端并且形成封端副产物的条件下进行反应；以及c)在反应过程中移除封端副产物；由此形成脱封端的半胱氨酸蛋白质制剂，并且基本上所有在还原反应前存在于蛋白质分子的链间二硫键，在脱封端的半胱氨酸蛋白制剂中被保留。2.权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：在移除封端副产物时，向还原反应补充额外的还原剂。3.权利要求1或2所述的方法，其中至少60％封端的半胱氨酸残基是被脱封端。4.权利要求3所述的方法，其中至少70％封端的半胱氨酸残基是被脱封端。5.权利要求3所述的方法，其中至少80％封端的半胱氨酸残基是被脱封端。6.如前述任一权利要求所述的方法，其中所述蛋白质是抗体，封端和脱封端的半胱氨酸残基是工程化的半胱氨酸残基，并且脱封端的半胱氨酸蛋白质制剂是脱封端的工程化的半胱氨酸抗体制剂。7.权利要求6所述的方法，其中脱封端的工程化的半胱氨酸抗体制剂包括2个或多个选自下组的成员：具有至少2个脱封端的工程化的半胱氨酸残基并且没有封端的工程化的半胱氨酸残基的抗体分子；具有至少2个封端的工程化的半胱氨酸残基并且没有脱封端的工程化的半胱氨酸残基的抗体分子；和具有至少1个封端的工程化的半胱氨酸残基和至少1个脱封端的工程化的半胱氨酸残基的抗体分子。8.如权利要求6或7所述的方法，其中至少80％(优选地至少85％或至少90％)在还原反应前存在于所述抗体分子的链间二硫键，在脱封端的工程化的半胱氨酸抗体制剂中被保留。9.如权利要求6-8中任一所述的方法，其中至少90％存在于抗体制剂中的自由巯基来源于工程化的半胱氨酸残基。10.如权利要求6-9中任一所述的方法，其中在反应过程中移除封端副产物包括：透析和渗滤。11.如权利要求6-10中任一所述的方法，其中每个抗体分子在还原反应前包含至少3个链间二硫键。12.如权利要求6-10中任一所述的方法，其中每个抗体分子在还原反应前包含至少4个链间二硫键。13.如权利要求6-12中任一所述的方法，其中选择还原剂和还原条件，使得抗体分子中不超过20％的链间二硫键在还原反应中被转化为一对自由巯基。14.如权利要求6-12中任一所述的方法，其中选择还原剂和还原条件，使得抗体分子中不超过15％的链间二硫键在还原反应中被转化为一对自由巯基。15.如权利要求6-12中任一所述的方法，其中选择还原剂和还原条件，使得抗体分子中不超过10％的链间二硫键在还原反应中被转化为一对自由巯基。16.如权利要求6-12中任一所述的方法，其中选择还原剂和还原条件，使得抗体分子中不超过5％的链间二硫键在还原反应中被转化为一对自由巯基。17.如权利要求6-16中任一所述的方法，其中每个抗体分子具有至少2个工程化的半胱氨酸残基。18.如权利要求6-16中任一所述的方法，其中每个抗体分子具有至少4个工程化的半胱氨酸残基。19.如权利要求6-16中任一所述的方法，其中工程化的半胱氨酸残基位于抗体分子的重链恒定区。20.如权利要求6-16中任一所述的方法，其中工...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·L·梅亚，
申请(专利权)人：西雅图基因公司，
类型：发明
国别省市：美国;US