基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免疫试剂盒制备方法技术

本发明专利技术涉及基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免疫试剂盒制备方法；我们将结合酶联免疫检测和荧光检测两种技术，利用胰蛋白酶和肿瘤标志物相应抗体Ab2制得检测探针。探针、肿瘤标志物和包埋在酶联免疫ELISA试剂盒的另一种肿瘤标志物抗体Ab1通过抗体抗原之间的作用，形成一种类似夹心的结构，最后通过酶和荧光底物的作用产生荧光，对CA125这种卵巢癌相关肿瘤标志物进行定性定量的检测，建立蛋白标志物检测的新方法。本发明专利技术的特点在于：整个制备过程简单，适合于产业化生产；根据荧光底物的荧光特性，以及与酶的作用，可定性定量检测蛋白标志物，且特异性良好；整个检测过程，成本低廉且操作非常简便，建立了一种蛋白标志物检测的新方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及疾病检测
，更具体的是涉及一种基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免疫试剂盒制备方法。
技术介绍
近年来，随着人们的生活方式发生了急剧变化，精神压力也不断增大，我国肿瘤的发病率逐年攀升。其中，卵巢癌死亡率在妇科肿瘤中居首位，与乳腺癌不同，卵巢癌早期缺乏明显症状和有效筛查，生存率低。卵巢癌的肿瘤标志物根据其组织病理类型可分为多种亚型，其中上皮来源性肿瘤是最为常见的类型，现有肿瘤标志物大多也与卵巢上皮性癌密切相关，如CA125和人类附睾蛋白4(HE4)等。健康人群血清CA125含量很低，健康成人血清CA125浓度上限为35kU/L。CA125是重要的卵巢癌相关抗原，联合经阴道盆腔超声或其他标志物可以提高早期筛查特异性；CA125可用于鉴别良恶性卵巢包块，绝经后女CA125>95kU/L，阳性预测值达95％；此外，CA125是观察疗效、判断有无复发的良好指标。世界卫生组织已经作出最新的权威性的结论，恶性肿瘤患者如果能在发病早期发现，治愈率可以达到80％以上，所以肿瘤的早期诊断与治疗已经成为近年来研究的热点。由于酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays,ELISA)具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用。随着方法的不断改进、材料的不断更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验，都大大提高了ELISA的特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110是一种双酰胺衍生物的罗丹明110(R110)分子探针，是一个敏感的和有选择性的测定蛋白酶在溶液中或在活细胞内底物。这些荧光底物含有一种氨基酸或肽共价连接到每个R110的氨基，酶裂解后，非荧光双酰胺底物转化首先对荧光单酰胺然后R110，在荧光的进一步增加。使用荧光酶标仪基板可用于连续测量细胞提取物中的酶活性和纯化的酶制剂，或用于细胞内蛋白酶的检测与分析，流式细胞仪和荧光显微镜等。目前荧光检测因具有优异的光学性质已经被广泛应用于示踪、成像以及标记等方面，而ELISA则因为它的灵敏度高、特异性强等优点在检测领域处于特殊重要的地位。所以本文拟研制基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免疫试剂盒，对卵巢癌肿瘤标志物CA125进行检测，灵敏度提升了将近10000倍。
技术实现思路
鉴于蛋白标志物在肿瘤检测中的重要地位、荧光检测独特的光学性质以及酶联免疫检测技术的优势。我们将结合酶联免疫检测和荧光检测两种技术，利用胰蛋白酶和肿瘤标志物相应抗体Ab2制得检测探针。探针、肿瘤标志物和包埋在酶联免疫ELISA试剂盒的另一种肿瘤标志物抗体Ab1通过抗体抗原之间的作用，形成一种类似夹心的结构，最后通过酶和荧光底物的作用产生荧光，对CA125这种卵巢癌相关肿瘤标志物进行定性定量的检测，建立蛋白标志物检测的新方法，极大程度提高了检测灵敏度。本专利技术制备的基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免疫试剂盒，其特征是选用胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110特异性降解产生的荧光对卵巢癌肿瘤标志物CA125进行定量检测，其结构式如下：本专利技术的技术方案如下：一种基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免疫试剂盒制备方法；其步骤如下：1)将新配制的高碘酸钠NalO4溶液加入到胰蛋白酶Trypsin溶液中，室温下避光搅拌后，用醋酸盐缓冲液透析过夜处理，通过加入碳酸盐缓冲液使体系pH达到9.0～9.3，立即加入CA125标记抗体Ab2，室温下避光搅拌后加入少量硼氢化钠NaBH4充分反应后用PBS缓冲液透析过夜，得到酶联检测探针Trypsin-Ab2；2)将CA125包被抗体Ab1加入96孔酶标板，静置过夜处理后用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入BSA封闭处理后再次用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，之后加入标准CA125抗原缓慢摇晃孵育，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入上述酶联检测探针Trypsin-Ab2，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，最后加入胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110，用荧光酶标仪读取96孔酶标板荧光强度值。所述醋酸盐缓冲液是0.01MpH4.4的缓冲液；碳酸盐缓冲液是0.2MpH9.5的缓冲液；PBS缓冲液是0.15MpH7.4的缓冲液。所述胰蛋白酶：高碘酸钠质量比为1:0.8～1.2；胰蛋白酶：CA125标记抗体质量比为1:1～5；胰蛋白酶：硼氢化钠质量比为15:1。所述CA125包被抗体Ab1浓度为10～50μg/mL。所述洗涤缓冲液是含有0.05～0.5％Tween-20的0.01MpH7.4的PBS缓冲液。所述检测原理是根据胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110降解产生的荧光强度值和CA125标准抗原浓度之间的关系，定性定量检测卵巢癌肿瘤标志物CA125。通过高碘酸钠NalO4作用将CA125记抗体Ab2和胰蛋白酶Trypsin连接，得到酶联检测探针Trypsin-Ab2。将CA125包被抗体Ab1加入96孔酶标板，4℃过夜后用洗涤缓冲液洗涤96孔酶标板，加入BSA37℃封闭处理后用洗涤缓冲液洗涤96孔酶标板，在96孔酶标板加入待检样品37℃下反应后用洗涤缓冲液洗涤96孔酶标板，加入上述Trypsin-Ab2检测探针37℃下反应后用洗涤缓冲液洗涤96孔酶标板，加入胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110，最后用荧光酶标仪读数。如果检测样品有CA125抗原Ag存在，探针Trypsin-Ab2、CA125抗原Ag和包埋在96孔酶标板上的CA125包被抗体Ab1通过抗体抗原之间的作用，形成一种类似夹心的结构Trypsin-Ab2-Ag-Ab1，此时胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110在酶的作用下降解产生荧光；如果检测样品没有CA125抗原Ag存在，则96孔酶标板的检测探针Trypsin-Ab2将被洗涤缓冲液清洗，此时胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110不会降解，没有荧光出现。在96孔酶标板上加入不同浓度的标准CA125抗原，建立标准曲线，定性定量检测卵巢癌肿瘤标志物CA125。本专利技术制备的基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免疫试剂盒优势在于：1.采用胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110这种具有优异的光学性质的双酰胺衍生物的罗丹明110(R110)分子探针，通过酶的放大作用，将极大的提高检测灵敏度，降低检测非特异性吸附。2.采用酶联免疫检测ELISA这种具有灵敏度高、特异性强等优点的传统检测技术，有利于调高检测效率。3.采用高碘酸钠NalO4作用将CA125记抗体Ab2和胰蛋白酶Trypsin连接得到酶联检测探针Trypsin-Ab2，夹心结构降解荧光底物产生的荧光强度，定性定量检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免疫试剂盒制备方法，其特征是选用胰蛋白酶荧光底物(CBZ‑Ala‑Arg)2‑R110特异性降解产生的荧光对卵巢癌肿瘤标志物CA125进行定量检测，其结构式如下：。

【技术特征摘要】
1.一种基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免疫试剂盒制备方法，其特征是选用胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110特异性降解产生的荧光对卵巢癌肿瘤标志物CA125进行定量检测，其结构式如下：。2.权利要求1的基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免疫试剂盒制备方法，其特征在于步骤如下：1)将高碘酸钠NalO4溶液加入到胰蛋白酶Trypsin溶液中，室温下避光搅拌后，用醋酸盐缓冲液透析过夜处理，通过加入碳酸盐缓冲液使体系pH达到9.0～9.3，立即加入CA125标记抗体Ab2，室温下避光搅拌后加入硼氢化钠NaBH4充分反应后用PBS缓冲液透析过夜，得到酶联检测探针Trypsin-Ab2；2)将CA125包被抗体Ab1加入96孔酶标板，静置过夜处理后用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入BSA封闭处理后再次用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，之后加入标准CA125抗原缓慢摇晃孵育，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入上述酶联检测探针Try...

【专利技术属性】
技术研发人员：常津，武玉东，宫晓群，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12