大运输物向多孔基质上的细胞中的高效递送制造技术

技术编号:14679408 阅读:171 留言:0更新日期:2017-02-22 12:24
在各种实施方案中,提供了用于将大运输物(例如,细胞器、染色体、细菌等)递送至细胞中的方法和装置。在某些实施方案中,提供了将大运输物递送至真核细胞中的方法,所述方法涉及:提供设置在多孔膜的一侧上的真核细胞;提供处于设置在所述多孔膜的相对侧上的储存室中的溶液中的所述待递送的运输物;以及对所述储存室施加足以使所述运输物通过构成所述多孔膜的孔的压力,其中所述运输物通过细胞膜并进入所述细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2014年3月28日提交的USSN61/972,145的权益和优先权,所述专利全文出于所有目的以引用的方式并入本文。政府资助声明[不适用]
技术介绍
将宽1尺寸范围的运输物(cargo)传递至哺乳动物细胞中在许多生物学领域中是非常需要的,所述宽尺寸范围的运输物包括蛋白质、DNA、RNA、染色体、细胞核以及无生命颗粒,如量子点、表面增强拉曼散射(SERS)颗粒、以及微珠。诸如内吞作用的递送方法能够将运输物截获在核内体中,在核内体中低pH微环境和裂解酶经常使得运输物降解(Luo和Saltzman(2000)Nat.Biotechnol.18:33-37)。病毒和化学递送方法将运输物包装在病毒内或形成增强摄取的化学复合物(Naldini等人,(1996)Science,272:263-267;Felgner等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7413–7417)。然而,毒性、细胞类型特异性摄取以及更重要的是受限的运输物包装能力对运输物尺寸和可传递的细胞类型施加了相当大的约束(Luo和Saltzman,同上。)。物理传递方法包括电穿孔(Chu,等人(1987)NucleicAcidsRes.15:1311-1326)和声穿孔(Mitragotri(2005)Nat.Rev.DrugDiscovery,4:255-260),其产生随机分布的纳米级孔;以及光穿孔(TirlapurandKonig(2002)Nature,418:290-291;Vogel,等人(2005)Appl.Phys.B:LaserOpt.,81:1015-1047;Clark等人(2006)J.Biomed.Opt.,11:014034),其在激光焦点处在细胞膜上产生孔。通过这些孔,小运输物利用热扩散或利用电场被递送到细胞中。由于运输物扩散速度较慢且随着孔径增加而细胞活力降低,所以使用这些方法递送大运输物具有较低的效率(Stevenson等人(2006)Opt.Express,14:7125-7133)。微毛细管注射(King(2004)MethodsinMolecularBiology245:GeneDeliverytoMammalianCells1;HumanaPressInc.:Totowa,NJ)使用尖锐的尖端(lasstip)机械穿透细胞膜以用于递送。但是,为了维持细胞活力,来自膜穿透的机械性创伤将典型的移液管尖端直径限制在0.5um(Han等人(2998)J.Nanomed.Nanotechnol.Biol.Med.,4:215-225)。由于移液管堵塞和运输物剪切,所以大于移液管尖端的运输物不能被注射。电注射(其结合了电穿孔与微毛细管注射)已证明通过用电场弱化接触细胞膜,之后温和地机械穿透进入细胞而进行的小分子递送,诸如将RNA和质粒DNA递送至活细胞中(Boudes等人(208)J.Neurosci.Meth.,170:204-211;Kitamura等人(2008)Nat.Meth.,5:61-67)以及将细菌递送到人工脂质囊泡中(Hurtig和Orwar(2008)SoftMatter,4:1515-1520)。另选地,简单的脂质辅助显微注射(SLAM)技术(Laffafian和Hallett(1998)Biophys.J.,75:2558-2563)在玻璃微毛细管的尖端处并入合成脂质分子。SLAM微量移液管与细胞膜的接触允许脂质分子与细胞膜融合以形成用于运输物递送的连续和临时途径。这一方法避免了微量移液管尖端穿过细胞膜造成的z字形刺穿动作。然而,运输物与细胞膜之间的亲脂性相互作用会在细胞中产生不想要的生物效应,同样,在递送的运输物下,也将此方法限制于特定的细胞类型和运输物含量。概述在各个方面,本文涵盖的本专利技术可包括但无需限于以下实施方案中的任何一个或多个:实施方案1:一种将大运输物递送到真核细胞中的方法,所述方法包括:提供设置在多孔膜的一侧上的所述细胞;提供处于设置在所述多孔膜的相对侧上的储存室中的溶液中的所述运输物;以及对所述储存室施加足以使所述运输物通过构成所述多孔膜的孔的压力,其中所述运输物通过细胞膜并进入所述细胞。实施方案2:根据实施方案1所述的方法,其中所述储存室的容积在约10μL直至约500μL、或约40μL至约500μL、或约50μL至约400μL、或约60μL至约300μL、或约70μL至约200μL、或约80μL至约150μL、或约10μL直至约1mL、或约10μL直至约500μL、或约10μL直至约100μL的范围内。实施方案3:根据实施方案2所述的方法,其中所述储存室具有约100μL的容积。实施方案4:根据实施方案1-3中任一项所述的方法,其中所述多孔膜的厚度在约5μm至约30μm、或约5μm至约20μm、或约5μm至约15μm的范围内。实施方案5:根据实施方案4所述的方法,其中所述多孔膜具有约10μm的厚度。实施方案6:根据实施方案1-5中任一项所述的方法,其中所述多孔膜的平均或中值孔径在约100nm直至约20μm或直至约20μm、或约500nm直至约8μm、或约1μm直至约5μm的范围内。实施方案7:根据实施方案6所述的方法,其中所述多孔膜的中值或平均孔径为约1μm。实施方案8:根据实施方案6所述的方法,其中所述多孔膜的中值或平均孔径为约3μm。实施方案9:根据实施方案6所述的方法,其中所述多孔膜的中值或平均孔径为约5μm。实施方案10:根据实施方案1-9中任一项所述的方法,其中所述多孔膜具有约1×105个孔/cm2直至约1×107个孔/cm2、或约5×105个孔/cm2直至约5×106、或约1×105个孔/cm2直至约1×107个孔/cm2。实施方案11:根据实施方案10所述的方法,其中所述多孔膜在约1.6×106个孔/cm2下具有约1μm直径的平均孔径。实施方案12:根据实施方案10所述的方法,其中所述多孔膜在约8×105个孔/cm2下具有约3μm直径的平均孔径。实施方案13:根据实施方案1-12中任一项所述的方法,其中所述膜包括聚合物膜。实施方案14:根据实施方案1-12中任一项所述的方法,其中所述膜包括选自由以下组成的组的材料:尼龙膜、尼龙网、过滤膜、聚四氟乙烯(PTFE)膜、膨体聚四氟乙烯(ePTFE)膜、聚酯膜、聚醚醚酮(PEEK)膜、膨体聚醚醚酮(ePEEK)膜、聚乙烯(PE)膜、聚丙烯(PP)膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、乙基乙酸乙烯酯(EVA)膜、热塑性聚氨酯(TPU)膜、聚醚砜(PES)膜、聚碳酸酯膜和聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜。实施方案15:根据实施方案14所述的方法,其中所述膜包括聚酯膜、聚碳酸酯膜或聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜。实施方案16:根据实施方案1-15中任一项所述的方法,其中所述施加压力产生所述多孔膜的偏转。实施方案17:根据实施方案16所述的方法,其中所述偏转在约20μm、或约50μm、或约100μm、或约500μm直至约至约1cm、或直至约500mm、或直至约300mm、或直至约100mm的范围内。实施方案18:根据实施方案1-17中任一项所述的方法,其本文档来自技高网...
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【技术保护点】
一种将大运输物递送到真核细胞中的方法,所述方法包括:提供设置在多孔膜的一侧上的所述细胞;提供处于设置在所述多孔膜的相对侧上的储存室中的溶液中的所述运输物;以及对所述储存室施加足以使所述运输物通过构成所述多孔膜的孔的压力,其中所述运输物通过细胞膜并且进入所述细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.28 US 61/972,1451.一种将大运输物递送到真核细胞中的方法,所述方法包括:提供设置在多孔膜的一侧上的所述细胞;提供处于设置在所述多孔膜的相对侧上的储存室中的溶液中的所述运输物;以及对所述储存室施加足以使所述运输物通过构成所述多孔膜的孔的压力,其中所述运输物通过细胞膜并且进入所述细胞。2.根据权利要求1所述的方法,其中所述储存室的容积在约10μL直至约500μL、或约40μL至约500μL、或约50μL至约400μL、或约60μL至约300μL、或约70μL至约200μL、或约80μL至约150μL、或约10μL直至约100μL的范围内。3.根据权利要求2所述的方法,其中所述储存室具有约100μL的容积。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述多孔膜的厚度在约5μm至约30μm、或约5μm至约20μm、或约5μm至约15μm的范围内。5.根据权利要求4所述的方法,其中所述多孔膜具有约10μm的厚度。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其中所述多孔膜的平均或中值孔径在约100nm直至约20μm或直至约20μm、或约500nm直至约8μm、或约1μm直至约5μm的范围内。7.根据权利要求6所述的方法,其中所述多孔膜的中值或平均孔径为约1μm。8.根据权利要求6所述的方法,其中所述多孔膜的中值或平均孔径为约3μm。9.根据权利要求6所述的方法,其中所述多孔膜的中值或平均孔径为约5μm。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法,其中所述多孔膜具有约1×105个孔/cm2直至约1×107个孔/cm2、或约5×105个孔/cm2直至约5×106、或约1×105个孔/cm2直至约1×107个孔/cm2。11.根据权利要求10所述的方法,其中所述多孔膜在约1.6×106个孔/cm2下具有约1μm直径的平均孔径。12.根据权利要求10所述的方法,其中所述多孔膜在约8×105个孔/cm2下具有约3μm直径的平均孔径。13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法,其中所述膜包括聚合物膜。14.根据权利要求1-12中任一项所述的方法,其中所述膜包括选自由以下组成的组的材料:尼龙膜、尼龙网、过滤膜、聚四氟乙烯(PTFE)膜、膨体聚四氟乙烯(ePTFE)膜、聚酯膜、聚醚醚酮(PEEK)膜、膨体聚醚醚酮(ePEEK)膜、聚乙烯(PE)膜、聚丙烯(PP)膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、乙基乙酸乙烯酯(EVA)膜、热塑性聚氨酯(TPU)膜、聚醚砜(PES)膜、聚碳酸酯膜和聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜。15.根据权利要求14所述的方法,其中所述膜包括聚酯膜、聚碳酸酯膜或聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜。16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法,其中所述施加压力产生所述多孔膜的偏转。17.根据权利要求16所述的方法,其中所述偏转在约20μm、或约50μm、或约100μm、或约500μm直至约至约1cm、或直至约500mm、或直至约300mm、或直至约100mm的范围内。18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法,其中所述施加压力包括施加瞬时压力。19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法,其中所述施加压力包括施加压力约1毫秒直至约1分钟。20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法,其中所述施加压力包括通过端口将压力施加到所述储存室。21.根据权利要求1-19中任一项所述的方法,其中所述施加压力包括当所述腔室被填充和封闭时偏转所述储存室的壁。22.根据权利要求1-19中任一项所述的方法,其中所述施加压力包括通过所述储存室的壁注入溶液。23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法,其中所述提供处于设置在储存室中的溶液中的所述运输物包括将所述溶液通过端口引入所述储存室。24.根据权利要求1-22中任一项所述的方法,其中所述提供处于设置在储存室中的溶液中的所述运输物包括将所述运输物溶液移液至所述储存器中。25.根据权利要求1-22中任一项所述的方法,其中所述提供处于设置在储存室中的溶液中的所述运输物包括为所述储存室装料,之后将所述多孔膜放置于所述腔室之上或之内。26.根据权利要求1-22中任一项所述的方法,其中所述提供处于设置在储存室中的溶液中的所述运输物包括通过穿透所述储存室的壁的针注入所述溶液。27.根据权利要求1-22中任一项所述的方法,其中所述提供处于设置在储存室中的溶液中的所述运输物包括使所述溶液通过所述膜来为所述储存室装料。28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法,其中所述运输物包括选自由以下组成的组的一个或部分:天然染色体或染色体片段、合成染色体、细菌、合成颗粒、细胞内真菌、细胞内原生动物、包装在脂质体(例如脂转染胺)中的DNA和/或RNA,以及细胞器。29.根据权利要求28所述的方法,其中所述运输物包括细胞核。30.根据权利要求28所述的方法,其中所述运输物包括线粒体。31.根据权利要求28所述的方法,其中所述运输物包括染色体或染色体片段。32.根据权利要求28所述的方法,其中所述运输物包括人工染色体。33.根据权利要求28所述的方法,其中所述运输物包括细菌。34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法,其中所述细胞选自由以下组成的组:脊椎动物细胞、真菌细胞和酵母细胞。35.根据权利要求1-33中任一项所述的方法,其中所述细胞选自由以下组成的组:哺乳动物细胞、昆虫细胞和无脊椎动物细胞。36.根据权利要求35所述的方法,其中所述细胞包括哺乳动物细胞。37.根据权利要求35所述的方法,其中所述细胞包括人细胞。38.根据权利要求35所述的方法,其中所述细胞包括非人哺乳动物细胞。39.根据权利要求36-38中任一项所述的方法,其中所述细胞包括淋巴细胞或干细胞。40.根据权利要求39所述的方法,其中所述细胞包括选自由以下组成的组的干细胞:成体干细胞、胚胎干细胞、脐带血干细胞和诱导多能干细胞。41.根据权利要求36-38中任一项所述的方法,其中所述细胞包括分化的体细胞。42.根据权利要求1-33中任一项所述的方法,其中所述细胞包括来自细胞系的细胞。43.根据权利要求42所述的方法,其中所述细胞包括来自表1中列出的细胞系的细胞。44.根据权利要求42所述的方法,其中所述细胞包括来自选自由以下组成的组的细胞系的细胞:HeLa、美国国家癌症研究所的60个癌细胞系(NCI60)、ESTDAB数据库、DU145(前列腺癌)、Lncap(前列腺癌)、MCF-7(乳腺癌)、MDA-MB-438(乳腺癌)、PC3(前列腺癌)、T47D(乳腺癌)、THP-1(急性骨髓性白血病)、U87(胶质母细胞瘤)、从骨髓瘤克隆的SHSY5Y人成神经细胞瘤细胞,以及Saos-2细胞(骨癌)。45.根据权利要求1-44中任一项所述的方法,其中所述细胞通过以下中的一种或多种附着至所述多孔膜:吸附、粘附分子、离心力以及凝胶基体。46.根据权利要求1-44中任一项所述的方法,其中所述细胞在所述多孔膜上培养。47.根据权利要求1-44中任一项所述的方法,其中所述细胞在所述多孔膜上作为粘附层培养。48.根据权利要求46-47中任一项所述的方法,其中所述细胞在所述多孔膜上培养至汇合。49.根据权利要求1-48中任一项所述的方法,其中所述多孔膜不具有金属膜或金属纳米颗粒。50.根据权利要求1-49中任一项所述的方法,其中所述方法不涉及加热所述膜的表面。51.根据权利要求1-49中任一项所述的方法,其中所述方法不涉及用激光加...

【专利技术属性】
技术研发人员:TH·吴PY·E·邱M·A·泰特尔
申请(专利权)人:加利福尼亚大学董事会
类型:发明
国别省市:美国;US

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