一种提高木质纤维素基质水解酶产量的方法技术

本发明专利技术公开提供了一种提高半纤维素酶、纤维素酶或木质纤维素水解辅助酶蛋白在毕赤酵母中异源表达量的方法。本发明专利技术通过毕赤酵母密码子偏好的特性，对来源于黑曲霉Aspergillus niger的木聚糖酶(XynC)基因进行密码子优化，其优化后的核苷酸序列(AxynC)经人工合成，并构建重组毕赤酵母表达载体pPIC9K‑AxynC和pPICZαA‑AxynC。利用两步电击转化法，构建高产木聚糖酶的重组毕赤酵母，即将线性化的pPIC9K‑AxynC转化毕赤酵母GS115，获得了一株产酶能力较强的菌株。以该高酶活菌株作为宿主菌进行第二次电击转化，将线性化的pPICZαA‑AxynC电击转化该菌株，获得了一株高产木聚糖酶的双质粒重组毕赤酵母。通过检测表明，经过密码子优化的木聚糖酶基因能够在毕赤酵母中成功表达，而且利用两步电击转化法构建的高产木聚糖酶重组菌能稳定高效生产木聚糖酶，摇瓶水平酶活达到了410U/mL，发酵上清液中蛋白含量达到了0.37mg/mL。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程
详细地说，本专利技术涉及一种提高半纤维素酶、纤维素酶或木质纤维素基质水解相关的辅助酶蛋白在重组毕赤酵母中表达量的方法及其双质粒重组毕赤酵母的构建。
技术介绍
半纤维素酶、纤维素酶和木质纤维素基质水解相关的辅助酶都是一类多组分酶蛋白的总称，能够共同作用将难以被生物利用的木质纤维素水解为利于被生物利用的葡萄糖，因此被认为是潜力巨大的酶制剂之一。半纤维素酶和纤维素酶都属于糖苷水解酶，能够降解木质纤维素的半纤维素酶酶系包括随机切割木聚糖主链产生木寡糖的β-D-1,4内切木聚糖酶、β-D-1,4外切木糖苷酶和侧链水解酶(α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶以及乙酰木聚糖酯酶等)。纤维素酶系至少包括三类组分，分别为葡聚糖外切酶(CBH)，葡聚糖内切酶(EG)以及β-葡萄糖苷酶(BG)，其中EG作用于纤维素非结晶区，水解β-1,4糖苷键，可将线性纤维素多聚物截断生成大量纤维素小分子；CBH水解1,4-β-D-糖苷键，作用于线性纤维素多聚物末端，生成纤维二糖分子；BG则将纤维二糖水解成为葡萄糖。辅助酶主要包括AA9、植物扩展蛋白Expansin和膨胀因子Swollenin等。辅助酶不直接参与木质纤维素的水解，但在半纤维素酶和纤维素酶水解木质纤维素过程中加入辅助蛋白，可以明显提高其水解效率。在纤维素酶、半纤维素酶和辅助酶相互协同作用下，可以将地球上最丰富的生物高聚物—纤维素和半纤维素，转化为微生物可以容易利用的葡萄糖，通过发酵产生生物燃料，用以缓解目前能源短缺问题。半纤维素酶和纤维素酶来源广泛，主要来源于可培养的环境微生物，如黑曲霉、里氏木霉、白腐真菌、类芽孢杆菌和一些厌氧的嗜热细菌等。然而，这些自产酶天生具有一定的配比缺陷，就目前工业应用最为广泛的产纤维素酶真菌里氏木霉(Trichodermareesei)而言，其纤维素酶系中缺乏外切酶CBHII和β-葡萄糖苷酶BG，导致其纤维素酶系酶解效率低下。另外，无论是来源于生物的自产酶系还是人工制成的商业纤维素酶制剂，其中所含蛋白种类多达八十余种，导致半纤维素酶和纤维素酶核心酶组分的比酶活降低，从而造成木质纤维素水解效率低下。更为重要的是，不同木质纤维素原料中纤维素、半纤维素以及木质素的比例有显著差异，且经预处理的木质纤维素也有半纤维素的残留，这些因素共同导致了木质纤维素水解效率低，酶用量大。所以，纤维素酶制剂的重新设计和定制为木质纤维素的高效水解、降低纤维素酶成本提供了新的研究思路。于是，利用半纤维素酶组分、纤维素酶组分和辅助酶进行复配，可以减少酶用量，提高木质纤维素的水解效率。因此，基于上述思路，获得半纤维素酶、纤维素酶和一些辅助酶单酶组分十分关键。近些年来，异源表达酶蛋白基因获得单酶组分引起了大量研究着的关注。Pichiapastoris可以实现翻译后修饰作用，如糖基化、二硫键形成，使蛋白可以进行正确折叠，并获得有活性的目标蛋白，另外，毕赤酵母并不产生内源性的与木质纤维素降解相关的酶组分，且胞外蛋白成分并不复杂，重组毕赤酵母菌发酵上清液甚至可以不经过纯化直接作为单酶制剂进行使用，因此，以Pichiapastoris作为首选宿主菌，实现酶(或蛋白)的异源表达以获得高浓度和高纯度半纤维素酶、纤维素酶和辅助酶等单酶组分，已成为研究热点。资料表明，提高外源基因在毕赤酵母中的表达量的途径之一是对外源基因进行密码子优化，通过密码子优化，不仅能实现外源基因的成功表达，同时还能提高目的产物的表达量。此外，通过筛选高拷贝转化菌株可以实现目的产物高产。另外，体外构建多拷贝目的基因的质粒(如专利CN101955958A和CN104046649A等)，通过同源重组来增加重组毕赤酵母中目的基因的拷贝数，从而提高了目的产物的产量。因此，本专利技术以毕赤酵母作为宿主菌，理性、高效地构建出高产半纤维素酶组分—木聚糖酶的重组毕赤酵母菌株，获取高酶活的木聚糖酶，为工业化应用奠定了基础。
技术实现思路
针对国内外现有木聚糖酶普遍存在木酶活不高的现状，能够提供工业生产木聚糖酶的基因工程菌很少。本专利技术对半纤维素酶中的一个重要组分—木聚糖酶的基因进行优化，优化后的木聚糖酶基因转化入毕赤酵母中，实现了木聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达。表达的木聚糖酶具有较高的活性，对于用于木质纤维素物料降解生产可发酵性单糖的应用，具有广泛的应用价值。本专利技术的目的是提供一种获取高酶活木聚糖酶的方法和一种优化的木聚糖酶基因，优化后的序列GC含量由52％降低为41.77％，优化前后序列同源性为76.83％，并构建pPIC9K-AxynC和pPICZαA-AxynC表达载体，以获取稳定高效的表达转化子。本专利技术提供的密码子优化后的木聚糖酶(XynC)基因和高产该木聚糖酶的双质粒重组毕赤酵母表达系统构建的具体步骤如下：1、木聚糖酶基因的优化：本专利技术对一种源于黑曲霉的木聚糖糖酶(XynC)基因进行密码子优化，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术利用GeneDesigner(DNA2.0,MenloPark)并基于毕赤酵母密码子偏好性对SEQIDNO.1进行优化，优化后的核苷酸序列，命名为AxynC，序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术提供的木聚糖酶分子量35.5kDa，密码子优化前后木聚糖酶XynC氨基酸序列无变化，其序列如SEQIDNO.3所示。2、表达载体的构建：以质粒pPIC9K和pPICZαA作为载体，将优化后的木聚糖酶基因AxynC插入启动子AOX1下游，5’端酶切位点为EcoRI，3’端酶切位点为NotI，构建pPIC9K-AxynC和pPICZαA-AxynC表达载体。3、高酶活菌株的构建及筛选：利用两步电击转化法，构建高产木聚糖酶的重组毕赤酵母表达系统，即以SacI作为pPIC9K-AxynC表达载体线性化位点，实现表达载体线性化，通过电击转化毕赤酵母，利用G418抗性筛选高酶活菌株。以高酶活菌株作为宿主进行第二次转化，即将SacI酶线性化的pPICZαA-AxynC电击转化以上高酶活菌株，利用高通量初筛，摇瓶酶活复晒法获得高产木聚糖酶的重组毕赤酵母菌株。4、优化产酶条件：以BMMY作为产酶培养基，优化培养基初始pH值、诱导剂(甲醇)量、培养温度和溶氧(摇床转数)，实现XynC稳定高效产酶。本专利技术有益效果：1、本专利技术实现了木聚糖酶(XynC)基因密码子优化，宿主菌为毕赤酵母菌，优化后降低了GC含量，由52％降低为41.77％，利用RNA二级结构折叠软件RNAstructure对优化后的核苷酸序列实现二级结构折叠，并调整碱基序列，使起始密码子端碱基呈开环结构，利于核糖体结合和木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达。2、本专利技术在重组毕赤酵母表达系统构建的过程中，利用两步电击转化法(或双质粒)，能有效提高目的基因在重组毕赤酵母中的拷贝数，与一步电击转化法(或单质粒)相比，避免了多次筛选的繁琐，两步电击转化法能更理性、更高效地获得高产重组毕赤酵母。3、本专利技术构建了含醇氧型启动AOX1的pPIC9K-AxynC和pPICZαA-AxynC的双质粒(或双抗性)重组菌株，以甲醇作为诱导剂，控制甲醇添加量，大幅度提高重组目的蛋白表达量。附图说明图1：木聚糖酶(XynC)基因优化前后序列的对比图。图2：构建的重组本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用双质粒重组毕赤酵母表达系统提高半纤维素酶、纤维素酶或木质纤维素基质水解相关辅助酶蛋白产量的方法，其特征在于通过构建高产半纤维素酶、纤维素酶或木质纤维素基质水解相关辅助酶蛋白的毕赤酵母表达系统来实现酶在胞外高效分泌。具体步骤如下：1)密码子优化：本专利技术利用软件Gene Designer基于毕赤酵母密码子偏好性，实现半纤维素酶、纤维素酶或木质纤维素基质水解相关辅助酶蛋白蛋白基因的优化。2)表达载体构建：以质粒pPIC9K和pPICZαA作为载体，将优化后的半纤维素酶或纤维素酶基因插入启动子AOX1下游，5’端酶切位点为EcoR I，3’端酶切位点为Not I，构建含有半纤维素酶、纤维素酶或辅助酶基因的重组表达载体。3)获取重组菌株：利用两步电击转化法，以Sac I作为pPIC9K重组表达载体(含有半纤维素酶、纤维素酶基因或辅助酶蛋白基因)线性化位点，实现表达载体线性化，通过电转化转入毕赤酵母，筛选高酶活菌株。随后，将Sac I线性化的pPICZαA重组表达载体(含有半纤维素酶、纤维素酶基因或辅助酶蛋白基因)表达载体电击转化入上述筛选到的重组毕赤酵母中，获得更高产酶能力的双质粒菌株。4)优化诱导产酶条件：以BMMY作为产酶培养基，优化培养基初始pH值、诱导剂(甲醇)量、培养温度和摇床转数(溶氧)，实现半纤维素酶、纤维素酶基因或辅助酶稳定高效产酶。...

【技术特征摘要】
1.一种利用双质粒重组毕赤酵母表达系统提高半纤维素酶、纤维素酶或木质纤维素基质水解相关辅助酶蛋白产量的方法，其特征在于通过构建高产半纤维素酶、纤维素酶或木质纤维素基质水解相关辅助酶蛋白的毕赤酵母表达系统来实现酶在胞外高效分泌。具体步骤如下：1)密码子优化：本发明利用软件GeneDesigner基于毕赤酵母密码子偏好性，实现半纤维素酶、纤维素酶或木质纤维素基质水解相关辅助酶蛋白蛋白基因的优化。2)表达载体构建：以质粒pPIC9K和pPICZαA作为载体，将优化后的半纤维素酶或纤维素酶基因插入启动子AOX1下游，5’端酶切位点为EcoRI，3’端酶切位点为NotI，构建含有半纤维素酶、纤维素酶或辅助酶基因的重组表达载体。3)获取重组菌株：利用两步电击转化法，以SacI作为pPIC9K重组表达载体(含有半纤维素酶、纤维素酶基因或辅助酶蛋白基因)线性化位点，实现表达载体线性化，通过电转化转入毕赤酵母，筛选高酶活菌株。随后，将SacI线性化的pPICZαA重组表达载体(含有半纤维素酶、纤维素酶基因或辅助酶蛋白基因)表达载体电击转化入上述筛选到的重组毕赤酵母中，获得更高产酶能力的双质粒菌株。4)优化诱导产酶条件：以BMMY作为产酶培养基，优化培养基初始pH值、诱导剂(甲醇)量、培养温度和摇床转数(溶氧)，实现半纤维素酶、纤维素酶基因或辅助酶稳定高效产...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙付保，张云博，张震宇，白仁惠，杨慧敏，王春迪，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32