本发明专利技术公开了维生素E修饰的聚乙烯亚胺衍生物及其合成方法和应用。所述制备方法包括：向维生素E中引入羧基得到vitE‑COOH，用CDI将其活化后直接与PEI进行反应，反应产物水溶液pH值调至8‑9后透析、冷冻干燥，即得。实验证明，维生素E的修饰有利于pDNA质粒的释放，其毒性随着PEI上的维生素E饰数目的增加而降低，维生素E的修饰能够大大增加pDNA质粒的细胞摄取蛋白的表达。体内实验表明PEI衍生物可成功将pDNA质粒输送到小鼠的肝脏和肺脏中，该复合物(PEI/pDNA)能进入肝脏和肺脏细胞并进一步释放质粒DNA和基因表达。本发明专利技术聚乙烯亚胺衍生物作为基因输送载体具有毒性低、转染效率高等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及聚乙烯亚胺衍生物，尤其涉及维生素E修饰的聚乙烯亚胺衍生物及其合成方法，本专利技术还涉及该维生素E修饰的聚乙烯亚胺衍生物作为基因输送载体的应用，属于聚乙烯亚胺衍生物领域。
技术介绍
基因治疗可用于治疗包括癌症、艾滋病、心血管病、传染性疾病等在内的各种获得性和遗传性疾病。基因治疗相对其它治疗方法有着若干优势，但在实际应用过程中也面临着一些挑战。因此，基因输送载体对于基因治疗来说是十分必要的。目前开发基因输送载体的策略主要分为病毒和非病毒介导的输送系统。病毒载体具有非常高的输送效率并且可以保证基因的长期表达，因此是目前临床上应用最多的载体。但病毒载体在临床使用过程中也暴露出了许多缺陷，这些缺陷大大限制了病毒载体的应用。为了克服病毒载体的诸多不足，近些年来非病毒载体得到了迅速发展。这其中就包括研究最广泛的非病毒载体聚乙烯亚胺。聚乙烯亚胺(PEI)是一种很常见的人工合成水溶性聚合物，它在废水处理和造纸业中有着非常广泛的应用。根据结构特点，PEI聚合物大致可以分为支链PEI和直链PEI。与直链PEI相比，多分支的PEI能够与DNA形成结合更紧密和颗粒更小的复合物。支链PEI与DNA的复合与直链高分子量PEI相比较对缓冲条件的依赖性更小，而直链高分子量PEI与DNA的复合很大程度上取决于缓冲条件。实验证明在高离子强度溶液中直链PEI(22kDa)与DNA复合可以形成较大尺寸的复合物(1μm)，而在5％葡萄糖中，观察到形成的复合物尺寸是30-60nm。PEI是最好的体外转染试剂之一并且已经被一些研究工作者当成聚合物类基因转染试剂的“金标准”。PEI的转染效率和细胞毒性主要受其分子量、支化程度、表面电势和粒径的影响。随着分子量的升高，支链PEI转染效率升高；然而，细胞毒性也同时升高。为了消除或降低与PEI有关的细胞毒性，目前已经发展出了多种不同的策略。[49-51]这些策略主要包括使用直链高分子量PEI，用多糖、亲水性聚合物(如PEG)、二硫键连接臂、脂质基团等取代或连接高分子量和低分子量的支链PEI(KoYT,KaleA,HartnerWC,Papahadjopoulos-SternbergB,TorchilinVP.JControlRelease.2009；133:132-8.GodbeyWT,WuKK,MikosAG.Sizematters:JBiomedMaterRes.1998；45:268-75.GraysonAC,DoodyAM,PutnamD.PharmRes.2006；23:1868-76.)。目前PEI及其衍生物已经应用于体内的核酸输送并且在癌症治疗等领域取得了令人满意的结果。有若干研究资料都涉及到通过PEI衍生物向体内输送核酸来达到治疗目的。这些衍生物包括多糖连接的PEI或交联的PEI纳米粒。研究表明使用诸如硫酸软骨素、透明质酸或葡聚糖等多糖修饰支链PEI(MW25kDa)可使聚合物毒性降低，从而改善其体内转染效率。基于直链PEI的转染试剂在市场上已经可以买到(例如ExGen500、jetPEI)。市场上销售的PEI分子量范围非常广泛，从1000Da以下到1.6×103kDa都有。通常认为最适用于基因输送的PEI的分子量在5kDa和25kDa范围内。PEI的转染效率随着分子量的增加而升高，但毒性也随之增加。25kDaPEI与1.8kDaPEI相比转染效率高上百倍，但毒性也显著增加。有若干研究证明，通过用小分子化合物对低分子量的PEI进行修饰可以显著提高转染效率而保持较低的毒性。例如，用胆固醇、磷脂、脂肪酸和硫辛酸等疏水性小分子修饰的PEI转染效率都比修饰前的提高数十倍到数百倍，而毒性也有不同程度的降低。在科学家发现聚乙烯亚胺(PEI)的基因输送功能之后的几十年来，有大量的研究表明对PEI进行疏水性修饰可以很好的提高转染效率并且降低细胞毒性。原因是多方面的，其中的主要原因可能是疏水性修饰不仅可以使聚合物更好的压缩DNA，使DNA分子变得更致密紧凑同时还可以增强聚合物/DNA复合物与细胞表面的结合，从而促进内吞作用，使DNA更有效的进入细胞。目前文献中常见的修饰基团主要是一些天然小分子疏水化合物，如胆固醇、磷脂等。维生素E是一种脂溶性化合物，它包括生育酚和生育三烯酚，其中α-生育酚是自然界中分布最广泛、含量最丰富并且活性最高的维生素E形式。维生素E的生物功能除了最熟知的抗氧化功能之外，还涉及酶活性的调节、基因表达调控以及神经生物学功能等。通过消化道吸收进入血浆的维生素E经受体介导进入肝细胞，进入肝细胞的维生素E又在维生素E结合蛋白的运输下进入肝外组织。维生素E本身的疏水性质、丰富的生物调节功能以及其受体介导的肝细胞摄取方式都预示着用它来修饰PEI很可能取得意想不到的效果。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种维生素E修饰的聚乙烯亚胺衍生物，所得到的衍生物作为基因输送载体具有毒性低、转染效率高等优点。本专利技术的目的之二是提供一种合成上述维生素E修饰的聚乙烯亚胺衍生物的方法为实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术首先公开了一种式Ⅰ所示的维生素E修饰的聚乙烯亚胺衍生物：其中，m或n为任意的整数；优选的，m为1至60的任意整数，n为1至60的任意整数；更优选的，m为4，n为2，4或6；或者m为54，n为10，20或40。本专利技术的另外一个目的是提供一种合成上述式Ⅰ所示的维生素E修饰的聚乙烯亚胺衍生物，该方法包括：(1)向维生素E中引入羧基得到vitE-COOH；(2)用CDI(N,N-羰基二咪唑)活化vitE-COOH得到活化酯；(3)活化酯直接与PEI进行反应，得到维生素E修饰的PEI衍生物。优选的，步骤(1)向维生素E中引入羧基的方法包括：将维生素E(vitE)和2-溴乙醇进行取代反应合成vitE-OH；将vitE-OH与己二酸进行偶联，将羧基引入到维生素E上得到vitE-COOH。优选的，步骤(2)中，在室温下，用CDI活化溶于无水DCM和TEA中的vitE-COOH得到活化活化酯；其中，所述的室温可以为15-30℃，优选为25℃。步骤(3)中活化酯与PEI在室温下进行反应，所述的室温可以为15-30℃，优选为25；为了达到更好的效果，优选的，将反应产物旋蒸除去溶剂，将残余物溶于蒸馏水得到水溶液，将反应产物的水溶液pH值调节到8-9后进行透析并冷冻干燥，得到维生素E修饰的PEI衍生物。为了在PEI上连接不同数目的维生素E，考虑向维生素E化学结构中引入羧基，最终通过该路线顺利合成出不同数目维生素E修饰的PEI衍生物。本专利技术最终在缀合反应之后用稀盐酸将所得PEI衍生物水溶液的pH调节到8-9，通过透析、冷冻干燥之后获得PEI衍生物的盐酸盐。通过控制合成原料之间的比例(即vitE-COOH:PEI投料比)可得到不同数目维生素E修饰的PEI衍生物。本专利技术进一步通过核磁共振氢谱和元素分析对具体的维生素E数目进行了定量。本专利技术通过1HNMR、FTIR和元素分析对所得维生素E修饰的PEI衍生物的结构进行了表征，确证所得产物即为目标产物。本专利技术进一步通过多种手段对合成得到的PEI衍生物的性能进行了表征，包括PEI衍生物的缓冲能力、PEI衍生物与DNA的结合能力、PEI衍生物在核酸酶环境和血清本文档来自技高网...
【技术保护点】
式Ⅰ所示的维生素E修饰的聚乙烯亚胺衍生物：其中，m或n为任意的整数。
【技术特征摘要】
1.式Ⅰ所示的维生素E修饰的聚乙烯亚胺衍生物：其中，m或n为任意的整数。2.按照权利要求1所述的聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，m为1至60的任意整数，n为1至60的任意整数。3.按照权利要求1所述的聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，m为4，n为2，4或6；或者m为54，n为10，20或40。4.一种合成权利要求1-3任何一项所述的聚乙烯亚胺衍生物的方法，其特征在于，该方法包括：(1)向维生素E中引入羧基得到vitE-COOH；(2)用N,N-羰基二咪唑活化vitE-COOH得到活化酯；(3)活化酯直接与聚乙烯亚胺进行反应，得到维生素E修饰的PEI衍生物。5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)向维生素E中引入羧基的方法包括：将维生素E和2-溴乙醇进行取代反应合成vitE-OH；将vitE...
【专利技术属性】
技术研发人员：汤新景，刘金星，冯梦柯，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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