一种偶联抗体的仿生免疫磁球及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种偶联抗体的仿生免疫磁球及其制备方法，属于纳米材料技术领域。所述仿生免疫磁球以水溶性Fe3O4纳米团簇为核，外包细胞膜，细胞膜外共价偶联有具有修饰基团的抗体。通过制备Fe3O4纳米团簇，即MNC；制备修饰有叠氮胆碱的细胞膜碎片，即M；将MNC和M反应得到仿生磁球，修饰基团与抗体反应得到带有环炔化修饰基团的抗体；将仿生磁球溶液和带有环炔化修饰基团的抗体偶联获得本发明专利技术所述仿生免疫磁球。所述仿生免疫磁球分散性好且磁响应迅速，捕捉肿瘤细胞识别效率高且背景中几乎没有白细胞，捕捉到得肿瘤细胞活性好；所述制备方法原料来源广泛，在仿生免疫磁球构建上具有普适性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种偶联抗体的仿生免疫磁球及其制备方法，属于纳米材料

技术介绍
根据2014年世界卫生组织发布的《世界癌症报告》，2012年有1400万人被诊断患癌，预测到2035年这个数据将增至2400万。癌症已成为严重威胁人类生命健康的一类疾病，超过90％患者的死亡源于肿瘤转移。在肿瘤转移过程中，循环肿瘤细胞(CTC)扮演着非常重要的角色，这类丰度极低的癌细胞从肿瘤原发灶脱落并进入外周血循环。检测CTC可以为肿瘤转移、肿瘤预后、疗效监控提供参考。然而分离和检测CTC非常具有挑战性，CTC在血液中出现概率约为1个CTC/109个血细胞(白细胞：3×106mL-1～10×106mL-1，红细胞：3×109mL-1～9×109mL-1，血小板：2.5×108mL-1～4×108mL-1)。CTC富集技术主要包括免疫磁珠富集、密度梯度离心以及膜过滤等，其中，免疫磁珠富集技术应用最为广泛。与早期的微米磁珠相比，纳米磁珠比表面积高、分散性好，并且可以避免细胞活化，无需解离磁珠，可以直接进行后续实验。其中，超顺磁纳米磁珠在外加磁场作用下具有磁性，而在外加磁场移除后不具有磁性，这使得其在溶液中呈单分散态、不易团聚。超顺磁颗粒分散性好，是超顺磁纳米磁珠高效捕捉CTC的一大优势。为了保证磁颗粒的超顺磁性，传统的磁颗粒粒径小(约10nm)、磁性弱且难操纵，商业化系统如(Veridex公司)和(德国美天旎公司)需要特殊的仪器来提高外加磁场强度，从而实现磁分离。此外，磁富集技术还存在白细胞的非特异性吸附问题。例如：系统是唯一被食品药品监督局(FDA)批准用于转移性乳腺癌、结直肠癌或前列腺癌检测CTC的技术，通过结合特异性抗体的磁流体靶向CTC表面的EpCAM(上皮细胞黏附分子)抗原，然后在特定磁场的作用下分离CTC，但系统对白细胞有明显的非特异性吸附(1000个～3000个/7.5mL)，不利于下游的CTC分析。
技术实现思路
针对现有技术存在的缺陷，本专利技术的目的之一在于提供一种偶联抗体的仿生免疫磁球，所述仿生免疫磁球能在复杂的血液环境中高效捕捉极低丰度的循环肿瘤细胞、同时降低白细胞背景，为循环肿瘤细胞的检测、研究提供有力的手段。本专利技术的目的之二在于提供一种偶联抗体的仿生免疫磁球的制备方法。为实现本专利技术的目的，提供以下技术方案。一种偶联抗体的仿生免疫磁球，所述仿生免疫磁球以水溶性Fe3O4纳米团簇为核，其外包覆细胞膜，在细胞膜外共价偶联有具有修饰基团的抗体；所述Fe3O4纳米团簇由Fe3O4纳米单晶和聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)组成，带正电荷，粒径为30nm～196nm；所述抗体为Fc端具有赖氨酸残基的抗体；所述修饰基团为DBCO-PEGn-NHS，n＝1～2000，优选n＝4；所述修饰基团通过环炔化修饰与抗体上的氨基偶联。其中，优选所述Fe3O4纳米团簇的粒径为81nm；优选所述细胞膜为白细胞系J774A.1的细胞膜。一种本专利技术所述偶联抗体的仿生免疫磁球的制备方法，所述制备方法步骤如下：步骤一、Fe3O4纳米团簇(简称为MNC)的制备(1)在无氧环境下，将NaOH完全溶解到二乙二醇(Diethyleneglycol,DEG)中，制备得到NaOH储存液；其中，无氧环境可通过采用惰性气体脱氧处理和保护实现；可加热至100℃～150℃使NaOH完全溶解到DEG中，NaOH完全溶解时停止加热；可将NaOH储存液保持在50℃～100℃下储存备用；优选加热至120℃使NaOH完全溶解到DEG中；优选将NaOH储存液保持在70℃下储存备用；优选NaOH储存液采用如下方法制备：将DEG在惰性气体的环境下做脱氧处理，待氧气清除完全后，将NaOH溶解到DEG中，同时加热，升温至120℃，直到NaOH完全溶解时停止加热，所述制备过程全程都需惰性气体保护，得浅黄色溶液为NaOH储存液，保持在70℃下储存备。(2)将铁源、PEI与溶剂混合均匀后抽真空5min～30min，然后填充氩(Ar)气保护，加热至100℃～180℃，加入步骤一(1)所得的NaOH储存液，至溶液中NaOH的浓度为0.03mol/L～0.4mol/L，待溶液颜色变成黑色后加热至190℃～230℃，继续冷凝回流30min～2h，反应结束，得到含有带正电荷的MNC的反应液；待含有带正电荷的MNC的反应液冷却后，磁分离，移去反应液，将磁分离产物超声洗涤，再磁分离，移去反应液，得到磁分离终产物为MNC，将MNC悬浮于去离子水中制备得到MNC溶液；其中，所述溶剂为DEG，或DEG和乙二醇(Ethyleneglycol,EG)的混合液，所述混合液中EG与DEG的体积比为1:14～1:4，优选为2:13；所述铁源为含有Fe2+，常温下稳定、能够在所述溶剂中溶解且不发生反应的物质，优选为FeSO4·7H2O或FeCl2·4H2O；所述PEI作为交联剂和稳定剂使用；铁源与PEI的质量比为1:60～128:60；优选混合均匀后抽真空25min；优选加热至160℃，再加入步骤一(1)所得的NaOH储存液；优选加热至220℃继续冷凝回流1h，反应结束；优选将磁分离产物先分散于无水乙醇中超声洗涤，再分散于去离子水中超声洗涤；更优选在无水乙醇中反复超声洗涤3次，在去离子水中反复超声洗涤5次；可根据需要，通过调节抽真空的时间或NaOH储存液加入量制备不同粒径大小的MNC。步骤二、修饰有叠氮胆碱的细胞膜碎片(简称为M)的制备将细胞在细胞培养完全培养基中培养20h～28h，换入含有0.1mM～0.4mM叠氮胆碱(N3)的细胞培养完全培养基中培养22h～28h，收集细胞，重新悬浮于缓冲溶液中，用匀浆机对重新悬浮于缓冲溶液中的细胞进行间歇破碎，采用蔗糖密度梯度离心对所述间歇破碎后的细胞碎片进行分离提取，得到M；将M溶解于HepesC缓冲液(购于赛默飞世尔科技公司)中，得到M溶液。其中，优选在37℃，CO2浓度为5％的恒温培养箱中培养；优选在细胞培养完全培养基中培养24h；优选换入含有N3的细胞培养完全培养基中培养24h；优选所述细胞培养完全培养基为内含10％体积分数胎牛血清(FBS)、60μg/mL青霉素和100μg/m链霉素的DMEM完全培养基；优选含有N3的细胞培养完全培养基中含有0.1mM的N3；优选用DispersersandShakers匀浆机2档对收集的细胞进行间歇破碎。步骤三、偶联抗体的仿生免疫磁球的制备(1)将MNC溶液、M溶液和磷酸缓冲盐溶液(PBS)混合，用混悬仪于恒温培养箱中反应4h～24h，磁分离，弃掉反应液，将磁分离产物，即仿生磁球重悬在PBS中，得到仿生磁球溶液；其中，M相对于MNC过量；优选用混悬仪于4℃恒温培养箱中反应12h；仿生磁球溶液可于4℃保存待用。(2)将修饰基团与抗体在PBS中混合得到混合液，将混合液孵育，除去未反应的修饰基团和抗体小分子，制备得到带有环炔化修饰基团的抗体的溶液。其中，修饰基团与抗体摩尔比为10:1～100:1，优选为50:1；优选混合液在4℃孵育2h～12h；除去未反应的修饰基团和抗体小分子可采用超滤或透析，优选在4℃，7000r/min下，在超滤管中超滤30min；带有环炔化修饰基团的抗体的溶液可本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种偶联抗体的仿生免疫磁球，其特征在于：所述仿生免疫磁球以水溶性Fe3O4纳米团簇为核，其外包覆细胞膜，在细胞膜外共价偶联有具有修饰基团的抗体；所述Fe3O4纳米团簇由Fe3O4纳米单晶和聚乙烯亚胺组成，带正电荷，粒径为30nm～196nm；所述抗体为Fc端具有赖氨酸残基的抗体；所述修饰基团为DBCO‑PEGn‑NHS，n＝1～2000；所述修饰基团通过环炔化修饰与抗体上的氨基偶联。

【技术特征摘要】
1.一种偶联抗体的仿生免疫磁球，其特征在于：所述仿生免疫磁球以水溶性Fe3O4纳米团簇为核，其外包覆细胞膜，在细胞膜外共价偶联有具有修饰基团的抗体；所述Fe3O4纳米团簇由Fe3O4纳米单晶和聚乙烯亚胺组成，带正电荷，粒径为30nm～196nm；所述抗体为Fc端具有赖氨酸残基的抗体；所述修饰基团为DBCO-PEGn-NHS，n＝1～2000；所述修饰基团通过环炔化修饰与抗体上的氨基偶联。2.根据权利要求1所述的一种偶联抗体的仿生免疫磁球，其特征在于：所述修饰基团为DBCO-PEGn-NHS，n＝4；所述Fe3O4纳米团簇的粒径为81nm；所述细胞膜为白细胞系J774A.1的细胞膜。3.一种如权利要求1或2所述的偶联抗体的仿生免疫磁球的制备方法，其特征在于：制备方法步骤如下：步骤一、Fe3O4纳米团簇，即MNC的制备(1)在无氧环境下，将NaOH完全溶解到DEG中，制备得到NaOH储存液；(2)将铁源、PEI与溶剂混合均匀后抽真空5min～30min，然后填充氩气保护，加热至100℃～180℃，加入NaOH储存液，至溶液中NaOH的浓度为0.03mol/L～0.4mol/L，溶液颜色变成黑色后加热至190℃～230℃，继续冷凝回流30min～2h，得到含有带正电荷的MNC反应液；待含有带正电荷的MNC的反应液冷却后，磁分离，移去反应液，将磁分离产物超声洗涤，再磁分离，移去反应液，得到磁分离终产物为MNC，将MNC悬浮于去离子水中制备得到MNC溶液；其中，所述溶剂为DEG，或DEG和EG的混合液，所述混合液中EG与DEG的体积比为1:14～1:4；所述铁源为含有Fe2+，常温下稳定、能够在所述溶剂中溶解且不发生反应的物质；铁源与PEI的质量比为1:60～128:60；步骤二、修饰有叠氮胆碱的细胞膜碎片，即M的制备将细胞在细胞培养完全培养基中培养20h～28h，换入含有0.1mM～0.4mM叠氮胆碱的细胞培养完全培养基中培养22h～28h，收集细胞，重新悬浮于缓冲溶液中，用匀浆机对重新悬浮于缓冲溶液中的细胞进行间歇破碎，采用蔗糖密度梯度离心对所述间歇破碎后的细胞碎片进行分离提取，得到M；将M溶解于HepesC缓冲液中，得到M溶液；步骤三、偶联抗体的仿生免疫磁球的制备(1)将MNC溶液、M溶液和磷酸缓冲盐溶液混合，用混悬仪于恒温培养箱中反应4h～24h，磁分离，弃掉反应液，将磁分离产物，即仿生磁球重悬在磷酸缓冲盐溶液中，得到仿生磁球溶液；(2)将修饰基团与抗体在磷酸缓冲盐溶液中混合得到混合液，将混合液孵育，除去未反应的修饰基团和抗体小分子，制备得到带有环炔化修饰基团的抗体的溶液；修饰基团与抗体摩尔比为10:1～100:1；(3)将仿生磁球溶液和带有环炔化修饰基团的抗体溶液在磷酸缓冲盐溶液中混合，并在4℃～37℃混悬1h～4h，得到所述的一种偶联抗体的仿生免疫磁球。4.根据权利要求3所述的一种偶联抗体的仿生免疫磁球的制备方法，其特征在于：步骤一中：(1)无氧环境通过采用惰性气体脱氧处理和保护实现；加热至100℃～150℃使NaOH完全溶解到DEG中，NaOH完全溶解时停止加热；(2)DEG和EG的混合液中，EG与DEG的体积比为2:13；所述铁源为FeSO4·7H2O或FeCl2·4H2O；混合均匀后抽真空25min；加热至160℃，再加入步骤一(1)所得的NaOH储存液；加热至220℃继续冷凝回流...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢海燕，熊珂，王书敏，魏炜，赵东旭，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11