用于胃癌诊断试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于胃癌诊断试剂盒，包括捕获抗体，所述捕获抗体是人血管生成素样蛋白2制得的单克隆抗体；所述试剂盒还包括检测抗体，所述检测抗体为人血管生成素样蛋白2制得的多克隆抗体。本发明专利技术的有益效果如下：具有灵敏度高准确性强的特点，其灵敏度及准确性均达到70%以上。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及癌症诊断检测用的试剂盒领域，具体为一种用于胃癌诊断试剂盒及其检测方法。
技术介绍
胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，全球发病率在恶性肿瘤中居第4位，病死率居第2位，我国是胃癌高发地区，每年新发胃癌病人40余万例，占据全球年新增病例的50%。由于大部分胃癌来自于胃溃疡及胃炎的恶变，几乎所有的胃病都要进行胃癌的筛查。临床治疗发现，第一期胃癌治疗后的存活率达百分之八十，零期胃癌治疗后的存活率更接近百分之百，因此早期发现及治疗非常重要。肿瘤标志物(tumormarkers，TM)是指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身合成、释放，或由机体对肿瘤细胞反应而产生的标志肿瘤存在和生长的一类物质。这些物质在正常成人中不存在或者是在癌症患者中出现的水平显著高于正常人。目前肿瘤标志物检测技术被认为是早期发现无症状微灶肿瘤的唯一途径，这一检测技术可先于X光片、超声、CT、MRI或PET-CT等物理检查发现肿瘤。可用于高危人群恶性肿瘤的筛查，肿瘤诊断与鉴别诊断，评估治疗的效果，预测或监视肿瘤复发或转移。目前，医院出现的胃癌诊断试剂盒都是检测一些常见的肿瘤标记物，灵敏性及准确性都偏低。因主要是选定的肿瘤标记物单项检测往往有很大的局限性，难以满足早期快速诊断的要求。目前，市场上还没有针对胃癌的快速高效诊断试剂盒问世，严重影响到胃癌早期发现及治疗。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对以上述现有胃癌诊断存在的不足，提供一种灵敏度高、准确性强且使用方便高效的用于胃癌诊断试剂盒。本专利技术另一目的是提供一种用于胃癌诊断试剂盒的检测方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术采取的技术方案是：用于胃癌诊断试剂盒，包括捕获抗体，所述捕获抗体是人血管生成素样蛋白2制得的单克隆抗体。所述试剂盒还包括检测抗体，所述检测抗体为人血管生成素样蛋白2制得的多克隆抗体。所述捕获抗体为将人血管生成素样蛋白2克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到相应的抗原，将所述抗原免疫哺乳动物得到的相应单克隆抗体。所述捕获抗体的制备方法包括如下步骤：（1）抗原的制备：把人血管生成素样蛋白2的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原，此抗原也可作为标准品用；（2）捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的单克隆抗体为捕获抗体。所述检测抗体为将人血管生成素样蛋白2的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到相应的抗原，将所述抗原免疫哺乳动物得到的相应多克隆抗体。所述检测抗体的制备方法包括如下步骤：（1）抗原的制备：把人血管生成素样蛋白2的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原，此抗原也可作为标准品用；（2）检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的多克隆抗体为检测抗体。所述捕获抗体预先包被于微量滴定板的孔内，可以简化步骤，提高检测效率。用于胃癌诊断试剂盒的制备方法，其包括以下步骤：（1）抗原的制备：将人血管生成素样蛋白2的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作为标准品用；（2）捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；（3）检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体；（4）捕获抗体包被：①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)将浓度为1μg/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔；②.封盖微量滴定板并在4℃下孵育过夜；③.弃去包被液（碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的捕获抗体），并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200μlPBST（磷酸盐吐温缓冲液），在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去洗涤液，在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4℃环境中备用；（5）封闭和加样：每孔添加200μl封闭缓冲液（1.2％BSA/PBS），封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。用于胃癌诊断试剂盒的检测方法，其包括以下步骤：（1）抗原的制备：将人血管生成素样蛋白2的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原；（2）捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；（3）检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体；（4）捕获抗体包被：①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)将浓度为1μg/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔；②.封盖微量滴定板并在4℃下孵育过夜；③.弃去包被液（碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的捕获抗体），并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200μlPBST（磷酸盐吐温缓冲液），在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去洗涤液，在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4℃环境中备用；（5）封闭①.在微量滴定板的每个孔添加200μl封闭缓冲液（1.2％BSA/PBS），封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点；②.封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时；（6）加样①.将100μl的样品添加到每个孔，在37℃孵育60分钟;要得到准确的定量结果，通常做法是比较未知样品与标准曲线的信号。每个酶标板都必须测定标准品（两重测定或三重测定）和空白样，以确保准确性；②.弃去样品，并洗涤微量滴定板三次，每次在微孔中加入200μlPBST（磷酸盐吐温缓冲液）；③.将100μl浓度为0.5μg/ml的检测抗体添加到每个孔；④.封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时；⑤.用PBST洗涤微量滴定板四次；⑥.添加100μl标记二抗；⑦.封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时；⑧.用PBST洗涤微量滴定板四次；(7)检测①.将TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）溶液添加到每个孔，孵育15-30分钟，添加等体积的终止液，然后在450nm处读取光密度；②.由系列稀释液得到的数据绘制标准曲线，浓度标在X轴（对数标度）上，而吸光度标在Y轴（线性标度）上，通过内插法在此标准曲线上得出样品浓度。本专利技术从众多的肿瘤标记物中，筛选出新肿瘤标记物人血管生成素样蛋白2(ANGPTL2)组成胃癌快速诊断试剂盒。人血管生成素样蛋白2是属于先天免疫模式识别分子家族，含有C-末端纤维蛋白原结构域和N-末端整合素结合序列，它的结构特征表明是一种细胞外基质(ECM)蛋白，作为整合素配体参与细胞黏附和细胞间的相互作用。研究表明人血管生成素样蛋白2是一种新型恶性肿瘤高特异性的分子标记物。最近的研究也证实它是胃癌的理想标记物。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：具有灵敏度高准确性强的特点，其灵敏度及准确性均达到70%以上。附图说明图1是本专利技术用于胃癌诊断试剂盒的原理图；图2是本专利技术用于胃癌诊断试剂盒的检测抗体最佳工作浓度的选择对比图；图3是本专利技术用于胃癌诊断试剂盒的对临床血清标本的诊断及鉴别诊断对比说明图；图4是本专利技术胃癌诊断试剂盒特异性的检测对比图；图5是本专利技术胃癌诊断试剂盒敏感性的检测对比图；图6是本专利技术用于胃癌诊断试剂盒在胃癌治疗前后血中检测到人血管生成素样蛋白2的变化对比图。具体实施方式以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于胃癌诊断试剂盒，包括捕获抗体，其特征在于：所述捕获抗体是人血管生成素样蛋白2制得的单克隆抗体，所述试剂盒还包括检测抗体，所述检测抗体为人血管生成素样蛋白2制得的多克隆抗体；其制备方法包括如下步骤：（1） 抗原的制备：将人血管生成素样蛋白2的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原，其中，所述抗原作为标准品用；（2）捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；（3）检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体；（4）捕获抗体包被：①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液将浓度为 1μg/ml 的捕获抗体包被 微量滴定板的孔；②. 封盖微量滴定板并在 4℃ 下孵育过夜；③. 弃去包被液，并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入 200μl PBST，在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去洗涤液，在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4℃环境中备用；（5）封闭和加样：每孔添加 200μl 封闭缓冲液，封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。

【技术特征摘要】
1.一种用于胃癌诊断试剂盒，包括捕获抗体，其特征在于：所述捕获抗体是人血管生成素样蛋白2制得的单克隆抗体，所述试剂盒还包括检测抗体，所述检测抗体为人血管生成素样蛋白2制得的多克隆抗体；其制备方法包括如下步骤：（1）抗原的制备：将人血管生成素样蛋白2的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原，其中，所述抗原作为标准品用；（2）捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；（3）检测抗体的制备：将上...

【专利技术属性】
技术研发人员：余跃飞，万以叶，李其云，
申请(专利权)人：江西惠肽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江西;36