通过破囊壶菌PUFA合酶在油料作物中产生ω‑3长链多不饱和脂肪酸制造技术

本发明专利技术公开涉及用多不饱和脂肪酸(PUFA)合酶系统和一种或多种辅助蛋白遗传修饰的重组宿主生物，所述辅助蛋白允许和/或提高PUFA在宿主生物中的产生。本发明专利技术公开还涉及制造和使用这样的生物、以及从这样的生物获得的产物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】优先权声明本申请要求2013年11月26日提交的“通过破囊壶菌PUFA合酶在油料作物中产生ω-3长链多不饱和脂肪酸”的美国临时专利申请系列号61/909,289的申请日的权益。
本专利技术公开一般性地涉及用多不饱和脂肪酸(PUFA)合酶系统和一种或多种辅助蛋白遗传修饰的重组宿主生物(例如，植物)，所述辅助蛋白允许和/或提高PUFA在宿主生物中的产生。本专利技术还涉及制造和利用这种生物(例如，为了获得PUFA)的方法以及从这种生物获得的产物(例如，油和种子)。背景多不饱和脂肪酸(PUFA)被认为可用于营养、药物、和工业应用，以及其他目的。然而，对于许多长期的商业需求而言，天然来源(例如，鱼油和海藻油)以及来自化学合成的PUFA的当前供应不足，或者成本效益不高。来源于植物(例如，油料作物)的植物油相对价廉，没有与鱼油相关的污染问题，并被认为是可持续的。然而，商业开发的植物和植物油中发现的PUFA一般不包括更饱和或更长链的PUFA，一般仅仅包括诸如亚油酸(十八碳，具有在Δ9和12位置的2个双键，18:2Δ9,12)和亚麻酸(18:3Δ9,12,15)之类的脂肪酸。已经有人描述了通过修饰由植物内源性产生的脂肪酸而在植物中产生更饱和或更长链的PUFA。例如，已经有人描述，用编码脂肪酸延长酶和/或去饱和酶的不同基因遗传修饰植物，结果产生的叶或种子含有显著水平的更长链且更饱和的PUFA，如二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)，而且含有显著水平的混合较短链且较不饱和的PUFA。Qi等人，(2004)NatureBiotech.22:739；PCT国际专利公开No.WO04/071467；Abbadi等人，(2004)PlantCell16:1；Napier和Sayanova(2005)Proc.Nutr.Soc.64:387-93；Robert等人，(2005)FunctionalPlantBiol.32:473-79；美国专利公开No.2004/0172682；Petrie等人，(2012)PLOSOne7:e49165；和美国临时申请No.61/345,537(2010年5月17日提交)。公开本文描述了方法和组合物，可用于在转基因宿主生物(例如，植物细胞、植物部分、和植物)中产生LC-PUFA，以及产生在此类PUFA中富集的大量非天然植物脂质，例如三酰甘油(TAG)和磷脂(PL)，并且产生相比于以往可得的PUFA主链更长且不饱和程度更高的PUFA。本文还描述了通过提供用功能性PUFA合酶系统遗传修饰的宿主生物而在宿主植物中产生PUFA的系统。本文中的一些实施方案包括遗传修饰的植物细胞(例如，芥花(canola)、大豆、和/或拟南芥植物细胞)，所述植物细胞包含编码来自破囊壶菌——裂殖壶菌藻(Schizochytriumalga)(其代表性例子是以ATCC登录号PTA-9695保藏(保藏日2009.1.7)的裂殖壶菌属物种)的多不饱和脂肪酸(PUFA)合酶(PFA1、PFA2、和PFA3)的至少一种多肽，和来自蓝藻细菌属—念珠藻属(Nostoc)的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(HetI)的多核苷酸，所述多核苷酸的表达产物重构功能性PUFA合酶系统。例如，植物细胞可包含编码裂殖壶菌PFA1、PFA2、和PFA3；以及念珠藻属HetI的多核苷酸。在一些实施方案中，植物细胞还包含至少一种编码脂酰CoA合成酶同工酶2(SzACS2)的多核苷酸。在具体的实施方案中，还在宿主植物细胞中表达了编码至少一种DHA优选辅助蛋白的多核苷酸，以促进LC-PUFA掺入到种子油中(例如，ACS、DGAT、LPAT、LPCAT、和PDAT)。本文中的具体实施方案包括：包括这样的植物细胞的遗传修饰植物(例如，芸苔属、大豆属、拟南芥属、和油料作物)，以及其后代、种子、组织、或部分。在具体的实施方案中，遗传修饰的植物细胞为油料作物细胞；例如，但不限于，红花、向日葵、和棕榈。表达功能性PUFA合酶系统的遗传修饰的油料作物细胞可生成特征性的脂肪酸概貌，例如，包括含DHA的植物油的脂肪酸概貌。一些实施方案提供了编码功能性PUFA合酶系统的组分(例如，裂殖壶菌PFA1、PFA2、PFA3，和念珠藻属HetI)以及任选地至少一种辅助蛋白(例如，SzACS2)的多核苷酸。在一些实例中，这些多核苷酸被包含在单个重组表达载体中。在其他实例中，这些多核苷酸被包含在不同的重组表达载体中。在具体的实施方案中，编码功能性PUFA合酶系统的组分以任选地至少一种辅助蛋白的多核苷酸与种子特异性启动子可操作连接。例如，在特定实例中所述多核苷酸可与选自PvDlec2；PvPhas；LfKCS3；FAE1；BoACP；BnaNapinC；SSPRO2745.1；和SSPRO2743.1的启动子可操作连接，这些启动子元件在本文中有示例。在一些实施方案中，多核苷酸与组成型启动子(例如，泛素和CsVMV启动子)、或叶特异性启动子可操作连接。在具体的实施方案中，可以采用另外的启动子在不同的生长阶段和/或在种子发育期间以更高的水平(例如，为了提供增加的LC-PUFA积累)驱动功能性PUFA合酶系统的表达。在其他实施方案中，编码功能性PUFA合酶的组分的多核苷酸编码：包含与SEQIDNO:1至少80％相同的氨基酸序列的多肽；包含与SEQIDNO:4至少80％相同的氨基酸序列的多肽；和/或包含与SEQIDNO:7或SEQIDNO:14至少80％相同的氨基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸还包含HetI基因(例如，编码与SEQIDNO:10的编码产物具有至少80％同一性的多肽的多核苷酸)。在一些实施方案中，所述多核苷酸还包含SzACS2基因(例如，编码与SEQIDNO:11的编码产物具有至少80％同一性的多肽的多核苷酸)。在具体的实例中，编码功能性PUFA合酶的组分的多核苷酸包括：与SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:3至少70％相同的多核苷酸；与SEQIDNO:5和/或SEQIDNO:6至少70％相同的多核苷酸；与SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、和/或SEQIDNO:13至少70％相同的多核苷酸；和/或编码与SEQIDNO:10至少80％相同的多肽的多核苷酸。在某些实例中，多核苷酸还包括编码与SEQIDNO:11具有至少80％同一性的多肽的多核苷酸。在具体的实例中，编码功能性PUFA合酶的组分的多核苷酸在严格条件(例如，极严格条件)下与SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:3；SEQIDNO:5和/或SEQIDNO:6；SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、和/或SEQIDNO:13；SEQIDNO:10；和/或SEQIDNO:11杂交。在某些实例中，多核苷酸在严格条件下与SEQIDNO:2；SEQIDNO:5；SEQIDNO:8；SEQIDNO:10；和SEQIDNO:11中的全部杂交。本文中还描述了产生转基因植物的方法，其中所述方法包括将编码功能性PUFA合酶的组分的多核苷酸导入植物细胞中；和从所述植物细胞再生植物。在一些实施方案中，多核苷酸在单个载体中被转化到作物细胞中。在其他实施方案中，多核苷酸介由多个载体转化到作物细胞中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种遗传修饰植物，其包含：编码来自产生具有显著水平的二十碳五烯酸(C20:5，n‑3)(EPA)的油的裂殖壶菌(Schizochytrum)的多不饱和脂肪酸(PUFA)合酶的至少一种多肽的多核苷酸，和编码来自念珠藻属物种的至少一种磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)的多核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.26 US 61/909,2891.一种遗传修饰植物，其包含：编码来自产生具有显著水平的二十碳五烯酸(C20:5，n-3)(EPA)的油的裂殖壶菌(Schizochytrum)的多不饱和脂肪酸(PUFA)合酶的至少一种多肽的多核苷酸，和编码来自念珠藻属物种的至少一种磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)的多核苷酸。2.权利要求1的遗传修饰植物的细胞、组织、或部分。3.权利要求1的遗传修饰植物，其中所述植物选自下组：高等植物；双子叶植物；单子叶植物；拟南芥；可消费植物；油料植物；大豆；油菜；芥花；亚麻；玉米；红花；向日葵；烟草；豆科植物；大豆属植物；花生；菜豆；蚕豆；和豌豆。4.权利要求1的遗传修饰植物，其中所述多核苷酸与下述的至少一种可操作连接：启动子；种子特异性启动子；叶特异性启动子；5’UTR；3’UTR；和终止序列。5.权利要求1的遗传修饰植物，其中所述多核苷酸与种子特异性启动子及终止序列可操作连接。6.权利要求1的遗传修饰植物，其中所述多核苷酸与选自下组的启动子可操作连接：PvDlec2；LfKCS3；FAE1；BoACP；BnaNapinC；泛素；CsVMV；SSPRO2745.1；和SSPRO2743.1启动子。7.权利要求1的遗传修饰植物，其中所述植物或其细胞、组织、种子、或部分包含可检出量的DHA(二十二碳六烯酸(C22:6，n-3))；和/或EPA(二十碳五烯酸(C20:5，n-3))。8.权利要求1的遗传修饰植物，其中所述植物或其细胞、组织、种子、或部分包含按总脂肪酸的重量计介于0.01％和15％之间的DHA量。9.权利要求1的遗传修饰植物，其中所述植物或其细胞、组织、种子、或部分包含按总脂肪酸的重量计介于0.05％和10％之间的DHA量。10.权利要求1的遗传修饰植物，其中所述植物或其细胞、组织、种子、或部分包含按总脂肪酸的重量计介于0.05％和5％之间的DHA量。11.权利要求1的遗传修饰植物，其中所述植物或其细胞、组织、种子、或部分包含按总脂肪酸的重量计介于0.01％和10％之间的EPA量。12.权利要求1的遗传修饰植物，其中所述植物或其细胞、组织、种子、或部分包含按总脂肪酸的重量计介于0.05％和5％之间的EPA量。13.权利要求1的遗传修饰植物，其中所述植物或其细胞、组织、种子、或部分包含按总脂肪酸的重量计介于0.05％和1％之间的EPA量。14.权利要求1-13中任一项的遗传修饰植物，其中所述植物或其细胞、组织、种子、或部分包含按总脂肪酸的重量计介于1:1和1:30之间的EPA:DHA比。15.权利要求14的遗传修饰植物，其中所述植物或其细胞、组织、种子、或部分包含按总脂肪酸的重量计介于1:1和1:3之间的EPA:DHA比。16.从权利要求1-15中任一项的遗传修饰植物获得的种子。17.从权利要求1-16中任一项的遗传修饰植物获得的商业产品。18.权利要求17的商业产品，其中所述商业产品包含：可检出量的编码来自产生具有显著水平的二十碳五烯酸(C20:5，n-3)(EPA)的油的裂殖壶菌的多不饱和脂肪酸(PUFA)合酶多肽的多核苷酸、或可检出量的来自产生具有显著水平的EPA的裂殖壶菌的PUFA合酶多肽；以及可检出量的编码来自念珠藻属物种的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)的多核苷酸、或可检出量的来自念珠藻属物种的PPT酶。19.权利要求18的商业产品，其中该产品进一步包含：可检出量的编码异源裂殖壶菌脂酰CoA合成酶(ACS)的多核苷酸、或可检出量的异源裂殖壶菌ACS。20.权利要求17的商业产品，其中该产品为：精制油；未精制油；粗制油；饲料或粕组合物；或功能食品。21.权利要求17的商业产品，其中该产品为油。22.一种调和油，其包含权利要求21的油和另一种油。23.一种获得包含至少一种PUFA的油的方法，该方法包括从权利要求1-15中任一项的遗传修饰植物或其细胞、组织、种子、或部分回收油。24.一种生产包含至少一种PUFA的油的方法，所述方法包括：培植权利要求1-15中任一项的遗传修饰植物；并且从该遗传修饰的植物、或从其细胞、组织、种子、或部分回收油。25.权利要求1的遗传修饰植物，其中所述植物包含下述的至少一种：与SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:3至少70％相同的多核苷酸；与SEQIDNO:5和/或SEQIDNO:6至少70％相同的多核苷酸；以及与SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、和/或SEQIDNO:13至少70％相同的多核苷酸。26.权利要求1的遗传修饰植物，其中所述植物包含下述的至少一种：SEQIDNO:2；SEQIDNO:3；SEQIDNO:5；SEQIDNO:6；SEQIDNO:8；SEQIDNO:9；和SEQIDNO:13。27.权利要求1的遗传修饰植物，其中PUFA合酶的多肽选自PFA1、PFA2、和PFA3。28.权利要求27的遗传修饰植物，其中所述多肽包含：与SEQIDNO:1至少80％相同的氨基酸序列；与SEQIDNO:4至少80％相同的氨基酸序列；和/或与SEQIDNO:7或SEQIDNO:14至少80％相同的氨基酸序列。29.权利要求27的遗传修饰植物，其中所述多肽包含：SEQIDNO:1；SEQIDNO:4；SEQIDNO:7；和/或SEQIDNO:14。30.权利要求1的遗传修饰植物，其中编码念珠藻属PPT酶的多核苷酸与SEQIDNO:10至少80％相同。31.权利要求30的遗传修饰植物，其中编码念珠藻属PPT酶的多核苷酸为SEQIDNO:10。32.权利要求1的遗传修饰植物，其中所述植物包含PFA1、PFA2、PFA3、和NoHetI。33.权利要求32的遗传修饰植物，其中PFA1、PFA2、PFA3、和NoHetI的编码区以头对尾构型布置。34.权利要求32的遗传修饰植物，其中PFA1和NoHetI的编码区以尾对尾构型布置，并且其中PFA3和PFA2的编码区以尾对尾构型布置。35.权利要求32的遗传修饰植物，其中PFA1和NoHetI的编码区以头对头构型布置，并且其中PFA3和PFA2的编码区以头对头构型布置。36.权利要求1的遗传修饰植物，其中至少一个所述多核苷酸在严格条件下与SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:3；SEQIDNO:5和/或SEQIDNO:6；SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、和/或SEQIDNO:13；和/或SEQIDNO:10的互补物杂交。37.一种遗传修饰植物，其包含编码来自产生具有显著水平的二十碳五烯酸(C20:5，n-3)(EPA)的油的裂殖壶菌的多不饱和脂肪酸(PUFA)合酶的至少一种多肽的多核苷酸；编码来自念珠藻属物种的至少一种磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)的多核苷酸；以及编码至少一种异源裂殖壶菌脂酰CoA合成酶(ACS)的多核苷酸。38.权利要求37的遗传修饰植物，其中所述裂殖壶菌ACS与SEQIDNO:11至少80％相同。39.权利要求38的遗传修饰植物，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·A·沃尔什，D·J·加绍特，C·M·拉森，S·A·贝文，P·A·O·默洛，J·G·梅茨，R·泽克尔，
申请(专利权)人：美国陶氏益农公司，帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US