本发明专利技术公开了一种牛源抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体、制备方法及其应用。本发明专利技术的真核表达单链抗体至少具有由如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的牛抗体轻链可变区VL和如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的牛抗体重链可变区VH以及由中间连接肽Linker按照VL‑Linker‑VH的顺序进行连接构成的牛源单链抗体片段VL‑Linker‑VH。将该片段的编码基因插入真核表达载体，构建成单链抗体真核表达质粒pcDNA3.1‑scFv后，将该pcDNA3.1‑scFv直接注射小鼠乳腺组织,能显著提高细胞因子IFN‑γ和IL‑4的含量(P<0.05),降低炎症因子TNF‑α的含量(P<0.05)，维持乳腺结构的相对完整，减少炎性细胞的浸润，对小鼠提供一定的保护作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种牛源抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体、制备方法及其用途，属于基因工程
技术介绍
单链抗体是一种基因工程抗体，通过DNA重组技术将抗体轻链可变区VL和重链可变区VH通过一段连接短肽linker首尾连接而成，是保留完整抗原结合部位的最小功能片段。单链抗体的表达形式主要有融合表达，胞内表达和分泌表达三种形式。和完整抗体相比，单链抗体具有以下优点：1)分子量小，大小仅为完整抗体的六分之一，免疫原性较低；2)组织穿透力强，容易进入实体瘤周围的微循环；3)血液清除快，肾脏蓄积很少；4)无Fc段，非特异结合低；5)易于通过基因工程大量生产；6)易于基因操作，更易构建重组免疫毒素。奶牛乳腺炎是影响奶牛业发展，给乳品生产造成巨大损失的一种常见多发病。引起奶牛乳腺炎的致病菌很多，其中金黄色葡萄球菌是最重要的致病菌，流行率达到了50％，导致的经济损失最大。主要是因为金黄色葡萄球菌具有传染性且治疗用的抗生素易产生耐药性，所以很难彻底治愈；目前针对金黄色葡萄球菌全菌和各个毒力因子的疫苗也用于奶牛乳腺炎的预防，但是效果均不理想。单链抗体等基因工程抗体，以其独特的抗病毒和抗细菌作用及可以大规模工程化制备的优势，显示了巨大的研发抗细菌药物的潜力，受到该领域高度重视。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种牛源抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体、制备方法及其用途。本专利技术的真核表达单链抗体能够与金黄色葡萄球菌特异性结合，且具有一定的抑菌活性，能够用于制备治疗金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎药物的研究。本专利技术技术方案具体介绍如下。本专利技术提供一种牛源性抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体，其至少具有如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列的牛抗体轻链可变区VL、如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的牛抗体重链可变区VH以及由中间连接肽Linker按照VL-Linker-VH的顺序进行连接构成的牛源单链抗体片段VL-Linker-VH。本专利技术中，所述的牛源单链抗体片段VL-Linker-VH具有如SEQIDNo.3所示的氨基酸序列。本专利技术还提供一种上述牛源性抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体的编码基因scFv。本专利技术还提供一种上述牛源性抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体的制备方法，具体步骤如下：(1)采用RT-PCR直接从患奶牛乳腺炎的外周血单个核细胞RNA中扩增出抗体编码基因的轻链可变区VL基因和重链可变区基因VH；(2)利用SOE-PCR法将连接肽linker与VL基因和VH基因相连构建牛源性单链抗体基因；(3)将步骤(2)的牛源性单链抗体基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中，构建重组质粒；(4)将步骤(3)的重组质粒转化入大肠杆菌，培养并用辅助噬菌体扩增建立初级单链抗体文库；(5)用金黄色葡萄球菌全菌作为包被抗原，富集淘选；(6)采用phageELISA,用金黄色葡萄球菌全菌作为包被抗原，筛选得到的阳性克隆即为牛源性抗金黄色葡萄球菌真核表达单链抗体。进一步的，本专利技术还提供上述牛源性抗金黄色葡萄球菌的真核单链抗体在制备治疗金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎药物中的用途。本专利技术的技术原理是采用RT-PCR直接从患奶牛乳腺炎的外周血单个核细胞RNA中扩增出牛抗体编码基因的重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因。利用SOE-PCR(重组链延伸反应)法，将linker与VH基因和VL基因相连构建牛源性单链抗体编码基因(scFv)，该scFv是按照VL-Linker-VH的顺序进行连接的，并将其克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中构建单链抗体初级文库，辅助噬菌体M13KO7拯救初级文库；用金黄色葡萄球菌全菌作为包被抗原经过四轮的富集淘选后，采用phageELISA方法筛选阳性克隆，证明该单链抗体具有抗金黄色葡萄球菌的体外中和活性，并测序后进行Clustalw多序列比较。本专利技术的独特之处，首先是在构建重组牛源单链抗体表码基因(ScFv)时，按照VL-Linker-VH的顺序，将牛抗体轻链可变区(VL)和牛抗体重链可变区(VH)用中间的Linker进行连接,构成的牛源单链抗体片段(VL-Linker-VH)，这样连接被本专利技术证明构建重组牛源scFv更为有效。而一般的文献报道都是按照VH-Linker-VL的顺序连接的；其次本专利技术将筛选到的阳性克隆的单链抗体编码基因(scFv)克隆到真核表达质粒pcDNA3.1，构建成单链抗体真核表达质粒pcDNA3.1-scFv，直接注射小鼠乳腺组织,可以在组织内表达单链抗体蛋白,抗体在体内持续时间长，能显著提高细胞因子IFN-γ和IL-4的含量(P<0.05),降低炎症因子TNF-α的含量(P<0.05)，维持乳腺结构的相对完整，减少炎性细胞的浸润，对小鼠提供一定的保护作用。本专利技术的有益效果是：抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体基因(scFv)直接注射小鼠乳腺,抗体在组织内持续表达，能与金黄色葡萄球菌特异性结合，能够用于奶牛乳腺炎的防控的进一步研究。附图说明图1是实施例1的噬菌粒载体pCANTAB5E的结构图。图2是phageELISA筛选到的8个scFv阳性克隆图示；注：NC为阴性对照，ZW1-ZW88为scFv阳性克隆。图3是重组质粒pcDNA3.1-scFvs双酶切鉴定图示；注：M.Marker2000；1.scFvZW12双酶切；2.scFvZW88双酶切。图4是Western-blot分析pcDNA3.1-scFvs在COS-1细胞中的表达图示；注：β-actin基因作为内参，1.未转染的COS-1细胞；2.转染空质粒pcDNA3.1；3.转染质粒pcDNA3.1-scFv12；4.转染质粒pcDNA3.1-scFv88。图5是Western-blot分析pcDNA3.1-scFvs在小鼠乳腺的表达时相图示；注：Western-blot分析pcDNA3.1-scFvs在小鼠乳腺的表达时向(n＝3),β-actin基因作为内参。生理盐水和空质粒pcDNA3.1分别为空白对照(C)和阴性对照(NC)，β-actin基因作为内参。图6是真核表达单链抗体注射后乳腺组织细菌计数图；注：图中数据均以平均值±标准误表示(n＝6)；不同字母标注的代表差异显著P<0.05，相同字母标注的代表差异不显著。图7是真核表达单链抗体(scFv)对细胞因子含量影响图；注：图中数据均以平均值±标准误表示(n＝6)；不同字母标注的代表差异显著P<0.05，相同字母标注的代表差异不显著，其中，(a)为TNF-α，(b)为IL-1β，(c)为IL-6。具体实施方式实施例中采用的实验材料均为正规公司获得的标准材料，所用方法均为标准试剂盒产品说明书所述方法，各步骤获得的中间产品及最后的终产品均经过多次试验证明可以重复获得，其生物学性质保持稳定一致。说明本专利技术各试验步骤所涉及的中间产品和终产品均可以按照本专利技术所陈述的方法准确获得。实施例1牛源噬菌体单链抗体库的构建1、采集患乳腺炎的奶牛血液，ELISA法检测血清抗体效价大于1:20000时，继续后续实验。将抗凝血提取牛外周血白细胞，用Trizol法(TRIZOLReagent购自TaKaRa公司)提取总RNA。以提取的总RNA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种牛源性抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体，其特征在于，其至少具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的牛抗体轻链可变区VL和如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的牛抗体重链可变区VH以及由中间连接肽Linker按照VL‑Linker‑VH的顺序进行连接构成的牛源单链抗体片段VL‑Linker‑VH。
【技术特征摘要】
1.一种牛源性抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体，其特征在于，其至少具有如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列的牛抗体轻链可变区VL和如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的牛抗体重链可变区VH以及由中间连接肽Linker按照VL-Linker-VH的顺序进行连接构成的牛源单链抗体片段VL-Linker-VH。2.根据权利要求1所述的牛源性抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体，其特征在于：所述的牛源单链抗体片段VL-Linker-VH具有如SEQIDNo.3所示的氨基酸序列。3.一种权利要求1所述的牛源性抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体的编码基因。4.一种根据权利要求1所述的牛源性抗金黄色葡萄球菌的真核表达单链抗体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)采用RT-P...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱建国，王曼，王婷婷，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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