本发明专利技术公开了一种重组腺病毒，属于生物医药领域。本发明专利技术的一种重组腺病毒，通过设计正向引物为，并向正引物的5’端加入保护碱基和Nae I酶位点；设计负向引物，并向负向引物的3’端加入保护碱基、终止子和MamH I酶切位点等四个步骤构建。本发明专利技术的一种重组腺病毒具有构建编码融合基因嵌合肽的重组腺病毒，并对其进行修饰，通过载体搭载重组腺病毒，对成骨肉瘤肿瘤细胞的增殖具有抑制作用，进一步能够促使成骨肉瘤肿瘤细胞凋亡的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生物医药，特别是一种重组腺病毒。
技术介绍
骨肉瘤是骨恶性肿瘤中最多见的一种，是从间质细胞系发展而来，肿瘤迅速生长是由于肿瘤经软骨阶段直接或间接形成肿瘤骨样组织和骨组织。目前常见的治疗方法有手术和放射，但手术治疗无法彻底根除肿瘤细胞，放射治疗对自身的健康细胞也会造成不可逆转的损伤；由于成骨肉瘤对化学药物的敏感性不高，目前没有有效的化学药物。p53基因是与人类肿瘤高度相关的抑癌基因之一，其中成骨肉瘤患者即存在着p53基因突变，失去了有功能的p53蛋白。野生型p53基因突变后产生的突变型p53蛋白石一种肿瘤促进因子，该蛋白可导致细胞失去DNA修复和控制分裂的能力，还可以抑制正常p53蛋白的功能，但是直接向肿瘤细胞内转导野生型p53基因的抑癌效果有限，无法达到抑制p53蛋白降解，基因治疗癌症的目的。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的在于：针对上述存在的问题，提供一种构建编码融合基因嵌合肽的重组腺病毒，并对其进行修饰，通过载体搭载重组腺病毒，对成骨肉瘤肿瘤细胞的增殖具有抑制作用，进一步能够促使成骨肉瘤肿瘤细胞凋亡的重组腺病毒。本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术的一种重组腺病毒，下述方法构建，步骤一，设计正向引物为F5’-GGGCCGGCGTGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAGAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAGAAGCTTAAGAAG，并向正引物的5’端加入保护碱基和NaeI酶位点；设计负向引物为R5’-GGGATCCTCATCCGCGCTGTACCTTTACCCAGAACTGATTCCGGCGCATCTTCCACTTCTTAAG，并向负向引物的3’端加入保护碱基、终止子和MamHI酶切位点；步骤二，经PCR反应体系扩增目的基因，连接于pGEM-T-easy质粒，转化入大肠杆菌E.ColiDH5α，经过克隆筛选、酶切鉴定、测序正确后，制备p53(C22)Ant片段，得到重组质粒pGEM-T/p53(C22)Ant；步骤三，通过NaeI和BamHI先后消化重组质粒pGEM-T/p53(C22)Ant，用DNA连接酶连入带有相同末端的已线性化的pBV220-NT4质粒，连接产物转化入大肠杆菌E.ColiDH5α，接种在含氨苄青霉素的LB培养液中，在37℃条件下培养过夜后挑选已转化的菌落，提取质粒、筛选并鉴定阳性克隆，得到pBV220/NT4p53(C22)Ant；步骤四，通过EcoRI和BamHI双酶切腺病毒穿梭质粒pSSHG-CMV和pBV220/NT4p53(C22)Ant，凝胶回收354bNT4p(C22)Ant的基因片段和pSSHG-CMV，用DNA连接酶连接，转入大肠杆菌E.ColiDH5α，挑选转化的菌落，提取质粒筛选并鉴定阳性克隆。由于采用了上述技术方案，p53羧基端肽的盘绕结构能够穿过细胞膜，捆绑在细胞内的靶点上，导致细胞凋亡，为选择性地诱导肿瘤细胞死亡，对正常或非肿瘤细胞无作用，并对p53变异型的肿瘤细胞作用更强，尤其是当p53羧基端肽和膜渗透肽嵌合后可以有效增强抗肿瘤作用。在表达盒中设计Ant穿膜肽可以不需任何膜蛋白shou体的协助而穿过活细胞质膜，进入细胞质设置细胞核，而细胞膜缺完好无缺，可有效的将多肽、蛋白质分子及DNA片段导入多种哺乳动物细胞，与细胞膜亲和性高，穿膜速度快，并能改善体内外病毒介导的基因转移和蛋白质的分泌表达。同时加入神经营养因子（NT4）信号肽，能够提高重组腺病毒的转导效率，引导肽与目的短肽相连接，保证正确切割和保持肽的生物活性，以获得最大的旁观杀伤效应。本专利技术的一种重组腺病毒，所述重组腺病毒经过叶酸修饰后与载体化学偶联。由于采用了上述技术方案，采用宿主细胞中磷脂“自然嵌合”的方法，在细胞培养的同时实现叶酸修饰磷脂对细胞膜的修饰，再用腺病毒对该叶酸修饰宿主细胞的侵染及在其中复制的过程，实现对重组腺病毒包膜的叶酸修饰，叶酸作为体内生化反应中一碳单位的载体，参与嘌呤和胸腺嘧啶的合成，并且通过从头合成途径进一步合成DNA和RNA，因此也算是可对细胞膜产生靶向作用的理想体，通过与叶酸受体作用使得纳米粒被细胞胞吞，从而提高转染率，有利于产生特异性的细胞靶向作用，也不会因为共价结合小分子后而改变。本专利技术的一种重组腺病毒，所述叶酸修饰包括以下几个步骤，步骤一，配置含有浓度为0.03mg/mL叶酸功能化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的细胞培养液，将宿主细胞悬浮在细胞培养液中悬浮5d；步骤二，调整细胞密度为5×106/mL，以MOI=0.5将重组腺病毒加入细胞悬浮液中，充分摇匀，铺于培养瓶中，在37℃、7.5%CO2浓度培养箱中培养48d；步骤三，收集悬浮细胞，将未悬浮细胞用细胞刮刀刮起，混匀两种细胞后，加入含1000U/mLGMCSF、1000U/mLIL-4和100ng/mLTNF-α的X-VIVO15培养基重新悬浮细胞，再按照MOI=0.3将重组腺病毒加入细胞悬浮液中，充分摇匀，铺于培养瓶中，在37℃、7.5%CO2浓度培养箱中培养48d；步骤四，收集上层清液，将上层清液置于50mL离心管中，在6500r/min转速下离心15min，经0.45μm过滤器过滤后超速离心，得到初步处理的病毒清液；步骤五，在离心管底部加入6mL25%蔗糖/PBS缓冲溶液作为缓冲垫，缓慢加入初步处理的病毒清液，在22300r/min转速下离心3h，弃去上层清液，沉淀用PBS（pH=7.2）溶解，再次超速离心进行脱糖。由于采用了上述技术方案，采用宿主细胞中磷脂“自然嵌合”的方法，可实现重组腺病毒的叶酸修饰，二者共定位效率为（94.2±0.7）%，经过叶酸修饰的重组腺病毒保持了很好的完整性，修饰后的重组腺病毒保持了对宿主细胞的感染能力；经过上述步骤，操作简便且最大程度保持了病毒的包膜完整性及感染能力，能够快速高效地获得叶酸修饰的重组腺病毒。本专利技术的一种重组腺病毒，所述重组腺病毒与载体化学偶联。由于采用了上述技术方案，与载体化学偶联后，能够保护重组腺病毒，具有较高的亲水性，保持细胞外稳定性，安全进入目标组织或细胞附近，而不被巨噬细胞识别、载体间无聚集，能够逃离溶酶体，在目标组织或细胞附近将基因载体，即重组腺病毒释放。本专利技术的一种重组腺病毒，其特征在于：所述载体为葡聚糖-酰腙凝胶纳米胶束，所述葡聚糖-酰腙凝胶纳米胶束的分子量为24300，胶束呈球形，胶束直径为为57.4±3.5nm，所述酰腙凝胶的分子式为，所述n：m=8：17。由于采用了上述技术方案，上述酰腙凝胶在一定的pH范围内具有可逆触变性能，在pH为7.2~7.8的范围内，能够形成水凝胶，在容器中可承受自身重力而不流动，但当pH小于7达到6.8及其以下时，酰腙键断裂，变为溶胶，当pH回升到7.2~7.8的范围时，又可形成凝胶；由于人体内正常的pH环境为7.0~7.8，当载体进入正常环境中，为凝胶状态，能够对重组腺病毒起到良好的保护作用；而肿瘤细胞周围的pH略偏酸性，约为6.85~6.95，因此当凝胶接近肿瘤细胞后，发成触变形成溶胶，将重组腺病毒释放，重组腺病毒靶向作用于肿瘤细胞，避免基因载体在作用于目标宿主前被巨噬细胞吞噬等，同时能够减小病毒对人体的毒性。葡聚糖可以在肝本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组腺病毒，其特征在于通过：下述方法构建，步骤一，设计正向引物为F5’‑GGGCCGGCGTGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAGAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAGAAGCTTAAGAAG，并向正引物的5’端加入保护碱基和Nae I酶位点；设计负向引物为R5’‑GGGATCCTCATCCGCGCTGTACCTTTACCCAGAACTGATTCCGGCGCATCTTCCACTTCTTAAG，并向负向引物的3’端加入保护碱基、终止子和MamH I酶切位点；步骤二，经PCR反应体系扩增目的基因，连接于pGEM‑T‑easy质粒，转化入大肠杆菌E.Coli DH5α，经过克隆筛选、酶切鉴定、测序正确后，制备p53(C22)Ant片段，得到重组质粒pGEM‑T/p53(C22)Ant；步骤三，通过Nae I和Bam H I先后消化重组质粒pGEM‑T/p53(C22)Ant，用DNA连接酶连入带有相同末端的已线性化的pBV220‑NT4质粒，连接产物转化入大肠杆菌E.Coli DH5α，接种在含氨苄青霉素的LB培养液中，在37℃条件下培养过夜后挑选已转化的菌落，提取质粒、筛选并鉴定阳性克隆，得到pBV220/NT4p53(C22)Ant；步骤四，通过EcoR I和BamH I双酶切腺病毒穿梭质粒pSSHG‑CMV和pBV220/NT4p53(C22)Ant，凝胶回收354b NT4p(C22)Ant的基因片段和pSSHG‑CMV，用DNA连接酶连接，转入大肠杆菌E.Coli DH5α，挑选转化的菌落，提取质粒筛选并鉴定阳性克隆。...
【技术特征摘要】
1.一种重组腺病毒，其特征在于通过：下述方法构建，步骤一，设计正向引物为F5’-GGGCCGGCGTGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAGAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAGAAGCTTAAGAAG，并向正引物的5’端加入保护碱基和NaeI酶位点；设计负向引物为R5’-GGGATCCTCATCCGCGCTGTACCTTTACCCAGAACTGATTCCGGCGCATCTTCCACTTCTTAAG，并向负向引物的3’端加入保护碱基、终止子和MamHI酶切位点；步骤二，经PCR反应体系扩增目的基因，连接于pGEM-T-easy质粒，转化入大肠杆菌E.ColiDH5α，经过克隆筛选、酶切鉴定、测序正确后，制备p53(C22)Ant片段，得到重组质粒pGEM-T/p53(C22)Ant；步骤三，通过NaeI和BamHI先后消化重组质粒pGEM-T/p53(C22)Ant，用DNA连接酶连入带有相同末端的已线性化的pBV220-NT4质粒，连接产物转化入大肠杆菌E.ColiDH5α，接种在含氨苄青霉素的LB培养液中，在37℃条件下培养过夜后挑选已转化的菌落，提取质粒、筛选并鉴定阳性克隆，得到pBV220/NT4p53(C22)Ant；步骤四，通过EcoRI和BamHI双酶切腺病毒穿梭质粒pSSHG-CMV和pBV220/NT4p53(C22)Ant，凝胶回收354bNT4p(C22)Ant的基因片段和pSSHG-CMV，用DNA连接酶连接，转入大肠杆菌E.ColiDH5α，挑选转化的菌落，提取质粒筛选并鉴定阳性克隆。2.如权利要求1所述的一种重组腺病毒，其特征在于：所述重组腺病毒经过叶酸修饰后与载体化学偶联。3.如权利要求2所述的一种重组腺病毒，其特征特在于：所述叶酸修饰包括以下几个步骤，步骤一，配置含有浓度为0.03mg...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑浩，
申请(专利权)人：成都测迪森生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51
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