本发明专利技术公开了提供一种双吲哚马来酰亚胺生物碱HD‑ZWM288（Bisindolymaleimide 288）抗肿瘤作用的新用途。即双吲哚马来酰亚胺生物碱(HD‑ZWM288)在制备抗肿瘤微管抑制剂药物的应用。经研究结果得知，双吲哚马来酰亚胺生物碱(HD‑ZWM288)可促进微管蛋白的解聚，影响微管的动态平衡，并且能够抗新生血管从而抑制肿瘤细胞的生长，是一种非常具有开发前景的微管抑制剂的化疗药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种双吲哚马来酰亚胺生物碱HD-ZWM288的抗肿瘤新用途，具体涉及双吲哚马来酰亚胺生物碱HD-ZWM288在制备抗肿瘤微管抑制剂的应用。
技术介绍
肿瘤是目前严重危害人类健康和生活质量的一类疾病，作用于微管的抗肿瘤药物是最有效的一类应用于临床的药物。该类药物利用微管的动力学特性，或促进其解聚或促进其聚合，从而达到直接影响细胞有丝分裂，并影响细胞的诸多正常生理功能，使细胞分裂停止于有丝分裂期（G2/M期），最终以细胞凋亡的形式引起肿瘤细胞死亡。但是，已有的微管蛋白抑制剂，例如，临床上广泛应用的长春新碱、紫杉醇普遍存在着耐药性、毒副作用等问题，极大的限制了这些药物的疗效和应用，因而，低毒抗耐药的新型微管抑制剂的发现是肿瘤治疗的一个研究热点，对抗肿瘤新药的发现具有重要而深远的意义。双吲哚马来酰亚胺生物碱HD-ZWM288是以天然产物为先导物优化修饰得到的新双吲哚马来酰亚胺类生物碱。吲哚马来酰亚胺生物碱类化合物具有蛋白激酶C抑制活性，但是是否具有其他重要的靶点作用及药理活性，值得深入研究。基于这一原因，我们利用微管靶点的筛选系统，发现HD-ZWM288具有促进微管解聚、破坏微管动态不平衡性、破坏纺锤体、阻滞细胞有丝分裂、引起细胞凋亡的通路和机制；具有肿瘤抗新生血管作用，并且动物抗肿瘤试验有效。是一种非常具有开发前景的化疗药物。
技术实现思路
本专利技术的目的是研究双吲哚马来酰亚胺生物碱HD-ZWM288抗肿瘤微管抑制剂的新用途。为了进行本专利技术的实验研究，首先合成得到双吲哚马来酰亚胺生物碱HD-ZWM288纯品，制成实验用药样品。双吲哚马来酰亚胺生物碱HD-ZWM288合成路线附图1：双吲哚马来酰亚胺生物碱HD-ZWM288促进微管蛋白的解聚、影响微管的动态平衡作用免疫荧光实验：将盖玻片铺于24孔板中，取对数生长期的人乳腺癌MCF-7细胞接种到24孔培养板中的圆形盖玻片上，置于培养箱中培养过夜爬片，然后用HD-ZWM-288处理细胞24h。然后取出，进行免疫荧光染色：（1）弃培养液，PBS洗涤2次，用甲醇/丙酮1:1室温固定5min。（2）PBS洗涤5min。（3）加入0.1%的Triton-10010min。（4）用PBS-TX洗涤3次，每次5min。（5）加入一抗，室温避光孵育4h（6）吸掉一抗，PBS-TX洗涤3次，每次5min。加入二抗室温避光1-2h。（7）吸掉二抗，，DAPI（2μg/ml）室温避光染色15min，条件下进行。（8）吸掉PBS-TX后，在载玻片上滴加抗荧光淬灭剂，将爬片反盖于载玻片上。共聚焦显微镜下观察并拍照。结果见附图2A提取细胞微管取对数生长期的人乳腺癌MCF-7细胞接种到6孔培养板中，置于培养箱中培养过夜，然后用0.1μMVCR（长春新碱）和HD-ZWM-288（0.25μM和0.5μM）分别处理细胞24h。（1）弃培养液，PBS洗涤2次。（2）加入100μl微管提取低渗溶液，置于37度5min.度（3）4度下14000rpm离心10分钟，取上清于新EP管中，这一部分为可溶的微管二聚体，沉淀则含有不溶性的聚合微管，将沉淀重新溶解在100μl低渗溶液中。（4）将两部分还有蛋白的溶液加入与之等体积的2×SDS-PAGEsamplebuffer，置于95度灭活5min，之后用Westernblot方法对蛋白含量进行分析。结果见附图2B影响微管的动态平衡方法：牛脑微管蛋白（>97％纯的微管蛋白）加入10ML的G-PEM缓冲液（80mMPIPES,2mgMgCl2,0.5mMEGTA,1.0mMGTP,pH6.9）、5％甘油、0.1％DMSO中于4℃混悬，然后加入供试品，按照试剂盒(Cat.BK004)的方法(CytoskeletonInc.,Denver,USA)，样品转入96孔板，340nm荧光分光光度计(Perkin–Elmer/WallacInc.,Freiburg,Germany).测定，每分钟一次共1h。结果见附图3细胞周期的抑制作用（1）取对数生长期的将人乳腺癌MCF-7细胞接种到6孔板中细胞密度为3×104/mL，培养过夜贴壁，用不同浓度的HD-ZWM-288作用于细胞24小时。（2）消化收集细胞，2000rpm离心5分钟，并用PBS洗2次，转移至EP管中。（3）每管用150μL冷PBS悬浮细胞，滴加350μL预冷的乙醇固定过夜。（4）PBS洗涤2次，加入100μLPBS重悬细胞，并加入1.5μLRnaseA（10mg/ml）于37度孵育30min（5）每管加入5μLPI（1mg/mL）,于4度避光1h。加入适量PBS于流式管中，调整细胞浓度为1×106/mL上流式细胞仪检测。计数20000个细胞，检测完后用CELLQuest软件分析细胞群体中G1、S、G2/M期细胞百分率。结果见附图4双吲哚马来酰亚胺生物碱HD-ZWM288对肿瘤细胞的生长抑制作用方法：取对数生长期的以上细胞株制成细胞悬液，接种于96孔板，每孔100μl，细胞密度为5000-10000/孔。置于37度、5%CO2的细胞培养箱中培养过夜贴壁后，分别用不同浓度的HD-ZWM-288处理细胞，同时设阴性对照组，即细胞中含有相同浓度的DMSO的对照组。继续培养12h、24h和48h后，每孔加入MTT（5g/L）溶液12μl，37度培养4h，吸去上清液，加入150μlDMSO，避光10min后，振荡摇匀，使结晶充分溶解。用酶标分析仪于570nm测定各孔OD值。重复三次取平均值。并且用软件计算IC50值。结果见表1表1HD-ZWM-288对多种肿瘤细胞和正常细胞的的细胞毒活性MTT实验测定HD-ZWM-288对多种肿瘤细胞和正常细胞的的细胞毒活性，将细胞置于不同浓度的HD-ZWM-288处理细胞12-24h，HD-ZWM-288作用于肿瘤细胞MCF-7、MDA-MB-231、U87、K562、A549、HELA和正常细胞RPE-1和HUVEC48h后的IC50结果如表1所示，从中发现HD-ZWM-288能够显著抑制人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231的增殖，尤其对MCF-7细胞株的毒性效果最好，IC50是0.62μM，并呈现剂量依赖性和时间依赖性。同时检测了HD-ZWM-288对另外两种正常细胞（RPE-1和HUVEC）的细胞毒活性。如表所示，HD-ZWM-288对这两种正常细胞的细胞毒活性比肿瘤细胞低，HD-ZWM-288处理48h，RPE-1和HUVEC的IC50分别是4.01和5.92μM。双吲哚马来酰亚胺生物碱HD-ZWM288抗新生血管作用划痕实验（1）先用Marker笔在6孔板背后用直尺均匀划横线，大约每隔0.5-1cm一道，每孔至少穿过5条线。（2）在每个孔中加入约5×105个细胞，过夜贴壁。（3）用进口200μL的枪头比着直尺尽量重叠于横线划痕。（4）用PBS冲洗细胞三次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。（5）放入置于37度，5%CO2细胞培养箱中培养，每间隔一定时间拍照。结果见附图5管形成实验（1）从-20度冰箱中取出Matrigel胶，在4度放置约1h使其融化。融化后将其铺于96孔板，每孔50μL，置于37度培养箱中使其凝固。（2）将HUVE本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种双吲哚马来酰亚胺生物碱HD‑ZWM288的抗肿瘤新用途，其特征在于：双吲哚马来酰亚胺生物碱HD‑ZWM288用于抗肿瘤微管抑制剂使用的新用途。
【技术特征摘要】
1.一种双吲哚马来酰亚胺生物碱HD-ZWM288的抗肿瘤新用途，其特征在于：双吲哚马来酰亚胺生物碱HD-ZWM288用于抗肿瘤微管抑制剂使用的新用途。2.根据权利要求书1所述的双吲哚马来酰亚胺生物碱HD-ZWM288的用于抗肿瘤微管抑制剂使用的新用途，其特征在于：双吲哚马来酰亚胺生物碱HD-ZWM288促进微管蛋白的解聚,影响微管的动态平衡用于抗肿瘤微管抑制剂的...
【专利技术属性】
技术研发人员：李霞，王颀林，张倩，
申请(专利权)人：山东大学威海，
类型：发明
国别省市：山东;37
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