本发明专利技术公开了一种检测甲胎蛋白的电化学免疫传感器及其制备方法，该电化学免疫传感器包括工作电极、参比电极和对电极，其中所述工作电极为先在基底电极表面修饰纳米金/氮掺杂石墨烯/壳聚糖复合材料，再分别固定甲胎蛋白抗体和牛血清蛋白所得。该电化学免疫传感器的制备方法包括以下步骤：（1）四氯金酸/氮掺杂石墨烯/壳聚糖复合材料的制备；（2）纳米金/氮掺杂石墨烯/壳聚糖复合材料修饰电极的制备；（3）构建电化学免疫传感器。本发明专利技术提供的电化学免疫传感器用于甲胎蛋白的检测具有灵敏度高、选择范围宽、稳定性高等、简单快速等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物免疫技术、电化学免疫传感器
，尤其涉及一种检测甲胎蛋白的电化学免疫传感器的制备方法。
技术介绍
甲胎蛋白（AFP）是一种糖蛋白，主要来自胚胎的肝细胞，在正常人的血清中AFP的含量不到20μg/L，但在肝癌患者中AFP的含量会有明显的增高，因此，AFP的检测对于早期肝癌的诊断具有重要的意义。目前检测AFP的方法很多，包括酶联免疫法（ELISA）、荧光免疫分析法（FIA）、放射免疫测定法（RIA）等，间接血酶法和琼脂双扩散法。这些方法前处理过程耗时、分析时间长、对设备要求极高、并且需要配备专门的技术人员，最关键的是这些传统的电化学分析过程通常是使用酶作为信号探针，但是用酶作标记，制备过程复杂、价格昂贵，并且酶容易失活导致不稳定。因此研究一种无标记的电化学免疫法成为了亟待解决的技术问题，学者们提出了电化学免疫传感器，电化学免疫传感器是将免疫学方法与电化学方法相结合的一种生物传感器，利用抗原与抗体之间的特性相结合，使得它具有高灵敏性、高选择性、高重现性、分析快速、操作简便、耗费低等优点。随着近年来纳米技术的快速发展，各种无机纳米材料如碳纳米管、金属纳米粒子、金属氧化物、半导体和石墨烯等已用于电化学免疫传感器的构建。介孔材料具有大的比表面积和良好的生物相容性，金属纳米材料具有导电性好、催化活性高、比表面积大而广泛应用于电化学传感器增敏方面。石墨烯（GS）是一种单层、片状的二维结构，近年来成为理论和实践关注的焦点。公开号为CN102507953A的中国专利公开了一种测定甲胎蛋白的电化学免疫传感器的制备方法，该方法包括如下步骤：（1）首先合成纳米介孔SiO2-纳米金复合材料，将辣根过氧化物酶、第二抗体固定到该复合材料上形成了复合物；（2）然后将硫堇-石墨烯复合物用于一抗的固定，从而制备了测定AFP的电化学免疫传感器，该免疫传感器成功地用于AFP的测定。公开号为CN103105497A的中国专利申请公开了一种检测甲胎蛋白的电化学免疫传感器的制备方法，通过将聚（3，4-乙烯二氧噻吩）、天青Ⅰ、ZnSe量子点及AFP抗体自组装修饰到铂盘电极上得到。它利用染料分子天青Ⅰ作为电子媒介体，与聚（3，4-乙烯二氧噻吩）共同构建了抗体分子的固定载体，用ZnSe量子点来吸附在复合物薄膜表面，用于结合抗体分子与辣根过氧化物酶，将ZnSe量子点的化学放大作用与免疫传感器的特异性相结合，融合两者的优点，增强了电化学检测AFP灵敏度和检测限。为了弥补现有技术AFP检测的不足，亟需研究一种检测AFP的电化学免疫传感器。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术第一方面提供了一种检测AFP的电化学免疫传感器，包括工作电极、参比电极和对电极，其中，所述工作电极为先在基底电极表面修饰纳米金/氮掺杂石墨烯/壳聚糖（Au/N-GS/CS）复合材料，再分别固定AFP抗体和牛血清蛋白（BSA）所得。其中，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为铂片电极，所述基底电极为玻碳电极（GCE）。其中，所述的Au/N-GS/CS复合材料，由壳聚糖（CS）、氮掺杂石墨烯（N-GS）和四氯金酸（HAuCl4）三者的混合溶液经电化学还原方法制备得到。本专利技术第二方面提供了一种检测AFP的电化学免疫传感器的制备方法，其中包括以下步骤：（1）四氯金酸/氮掺杂石墨烯/壳聚糖（HAuCl4/N-GS/CS）复合材料的制备：a、先将CS溶解在醋酸溶液中，加入碱溶液调节pH值至4.5～5.0，进行磁力搅拌制备得到CS溶液；b、再将N-GS溶解到所述CS溶液中，采用超声方法制备得到氮掺杂石墨烯/壳聚糖（N-GS/CS）溶液；c、最后将HAuCl4加入到所述的N-GS/CS溶液中，进行磁力搅拌制备得到HAuCl4/N-GS/CS复合材料混悬液；（2）Au/N-GS/CS复合材料修饰电极的制备：将GCE浸入到步骤（1）制备得到的HAuCl4/N-GS/CS复合材料混悬液中，采用铂片电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，进行沉积，最后用去离子水冲洗，晾干，得到Au/N-GS/CS复合材料修饰电极；（3）构建电化学免疫传感器：a、先将AFP抗体滴加到步骤（2）制备得到的所述工作电极上孵育，再用pH7.0的磷酸缓冲溶液洗掉与修饰电极结合不够稳定的AFP抗体，制备得到有抗体的Au/N-GS/CS复合材料修饰电极；b、再将BSA溶液滴加到所述的有抗体的Au/N-GS/CS复合材料修饰电极上，再用pH7.0的磷酸缓冲溶液洗掉与修饰电极结合不够稳定的BSA。其中，所述步骤（1）HAuCl4/N-GS/CS复合材料的制备中，所述CS、N-GS和HAuCl4的质量比为0.7:0.2～0.6:0.2~0.5。优选地，所述CS、N-GS和HAuCl4的质量比为0.7:0.3～0.5:0.2~0.4。其中，所述步骤（1）HAuCl4/N-GS/CS复合材料的制备中，步骤a的磁力搅拌时间为2～4h，步骤b的超声时间为40～120min，步骤c的磁力搅拌时间为30～90min。优选地，步骤a的磁力搅拌时间为2.5～3.5h，步骤b的超声时间为60～100min，步骤c的磁力搅拌时间为40～70min。进一步优选地，步骤a的磁力搅拌时间为3～3.5h，步骤b的超声时间为60～80min，步骤c的磁力搅拌时间为50～70min。其中，所述步骤（2）Au/N-GS/CS复合材料修饰电极的制备中，所述沉积的工作电位为-1.5V～1.1V，时间为1～3分钟。其中，所述步骤（3）构建电化学免疫传感器中，所述的AFP抗体的浓度为10~40μg/mL，所述的牛血清白蛋白的质量浓度为1~5%。优选地，所述的AFP抗体的浓度为15~30μg/mL，所述的牛血清白蛋白的质量浓度为1~5%。进一步优选地，所述的AFP抗体的浓度为20~30μg/mL，所述的牛血清白蛋白的质量浓度为2.5~4%。其中，所述步骤（3）中，所述的孵育的温度为人体正常温度，时间为90～120分钟。进一步优选地，孵育的时间为100～110分钟。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的电化学免疫传感器，通过在石墨烯的碳网格中引入含氮原子结构，不仅能够增加表面活性电位、调控能带结构、改善电化学性能、提高其在溶剂中的分散性，同时还能有效加强载体与金属纳米粒子的结合力、提高金属粒子的分散性、增强复合材料的稳定性；而引入的金纳米粒子能够改善其比表面积和生物亲和性；CS作为成膜材料具有优异的吸附性、透气性和渗透性。因此，本专利技术提供的电化学免疫传感器能够负载大量的AFP抗体，用于AFP的检测具有灵敏度高、选择范围宽、稳定性高等、简单快速等优点，同时本专利技术提供的电化学免疫传感器的制备方法还适用于其他肿瘤标志物的电化学免疫传感器的制备方法，在科研和临床应用具有广泛的前景。附图说明图1为本专利技术实施例1制备电化学免疫传感器的示意图；图2为本专利技术实施例1提供的电化学免疫传感器在不同浓度（0.005ng/ml，0.01ng/ml，0.1ng/ml，1ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml）的AFP的DPV图；图3为本专利技术提供的电化学免疫传感器检测不同浓度AFP时的标准本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测甲胎蛋白的电化学免疫传感器，包括工作电极、参比电极和对电极，其特征在于：所述工作电极为先在基底电极表面修饰纳米金/氮掺杂石墨烯/壳聚糖复合材料，再分别固定甲胎蛋白抗体和牛血清蛋白所得。
【技术特征摘要】
1.一种检测甲胎蛋白的电化学免疫传感器，包括工作电极、参比电极和对电极，其特征在于：所述工作电极为先在基底电极表面修饰纳米金/氮掺杂石墨烯/壳聚糖复合材料，再分别固定甲胎蛋白抗体和牛血清蛋白所得。2.根据权利要求1所述的电化学免疫传感器，其特征在于：所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为铂片电极，所述基底电极为玻碳电极。3.根据权利要求1所述的电化学免疫传感器，其特征在于：所述的纳米金/氮掺杂石墨烯/壳聚糖复合材料，由壳聚糖、氮掺杂石墨烯和四氯金酸三者的混合溶液经电化学还原方法制备得到。4.一种检测甲胎蛋白的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）四氯金酸/氮掺杂石墨烯/壳聚糖复合材料的制备：a、先将壳聚糖溶解在醋酸溶液中，加入碱溶液调节pH值至4.5～5.0，进行磁力搅拌制备得到壳聚糖溶液；b、再将氮掺杂石墨烯溶解到所述壳聚糖溶液中，采用超声方法制备得到氮掺杂石墨烯/壳聚糖溶液；c、最后将四氯金酸加入到所述的氮掺杂石墨烯/壳聚糖溶液中，进行磁力搅拌制备得到四氯金酸/氮掺杂石墨烯/壳聚糖复合材料混悬液；（2）纳米金/氮掺杂石墨烯/壳聚糖复合材料修饰电极的制备：将玻碳电极浸入到步骤（1）制备得到的四氯金酸/氮掺杂石墨烯/壳聚糖复合材料混悬液中，采用铂片电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，进行沉积，最后用去离子水冲洗，晾干，得到纳米金/氮掺杂石墨烯/壳聚糖复合材料修饰电极；（3）构建电化学免疫传感器：a、先将甲胎蛋白抗体滴加到步骤（2）制备得到的所述工作电极上孵育，再用pH7.0的磷酸缓冲溶液洗掉与修饰电极结合不够稳定的甲胎蛋白抗体，制备得到有抗体的纳米金/氮掺杂石墨烯...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢丽敏，徐景坤，贾海燕，邱新兰，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：江西;36
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