一种脾脏源转移因子的制备方法技术

本发明专利技术属于兽药领域，公开一种脾脏源转移因子的制备方法。该方法步骤包括脾脏前处理、绞肉匀浆、酸化、液氮冷冻、破碎微波解冻、离心纯化和干燥，其中匀浆时加入金刚砂、TritonX‑100和浓度70~80%的柠檬酸水溶液。本发明专利技术能显著缩短脾脏源转移因子TF的制备提取时间和提高转移因子的提取率，具有工艺简单、机械化程度较高，易便于规模流程标准化操作使用、可连续化操作、显著提高脾脏转移因子过滤效率，降低劳动强度和过滤纯化极易反向清洗的特点，该发明专利技术的脾脏源转移因子的制备方法适于产业化脾脏转移因子的工艺生产应用，具有突出的推广前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于兽药领域，具体涉及一种脾脏源转移因子的制备方法。
技术介绍
转移因子(Transferfactor,TF)作为一种新型免疫激发剂，是T淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的物质，它能够特异、高效地将供体的细胞免疫信息转移给受体，从而增强受体的免疫功能。从免疫学上，TF可分为特异性转移因子和非特异性转移因子两大类。目前研究发现TF转移因子的功能与作用机理分别为：①增强细胞免疫功能；②增强体液免疫；③增强非特异性免疫；④抗免疫抑制功能；⑤进机体的生长发育。脾脏TF以其富含多种氨基酸，无抗原性，无毒副作用，成为了一种安全的新型抗病毒生物制剂，广泛用于人与动物的病毒性疾病、细菌性疾病、真菌性疾病、寄生虫性疾病等疾病防治。尤其是特异性脾脏TF对目前用抗菌药物、抗病毒药物、疫苗等无法有效控制的病毒性疾病具有独特的疗效，其在兽医临床的应用具有广阔前景。转移因子存在于脾脏的淋巴细胞中，现有技术的转移因子制备方法普遍是将动物脾脏进行绞碎、破坏细胞结构使胞内转移因子释放到浆液中，再将浆液中的转移因子进行分离精制最终得到转移因子产品。反复冻融法和透析法是目前制取TF过程中使用较为普遍的方法，反复冻融法是指对动物脾脏进行-30℃低温冷冻再解冻的过程。透析法是指动物脾脏匀浆液的离心上清液进行若干次透析，实现对转移因子的分离纯化，上述两类方法操作简单，但生产周期长，操作费用高，劳动强度大，机械度较弱，且TF提取率不高，难以进行工业化规模和批量地生产，因此有必要开发一种脾脏源转移因子（TF）的制备新方法。
技术实现思路
为解决现有转移因子制备方法存在的生产周期长、提取率不高问题，本专利技术的目的旨在提供一种脾脏源转移因子的制备方法，该方法能显著缩短制备时间和提高TF提取率。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：一种脾脏源转移因子的制备方法，步骤如下：S1、前处理：筛选检疫合格的动物脾脏，然后去杂、清洗、消毒，沥干备用；S2、绞肉匀浆：（a）绞肉：对前处理后的脾脏进行绞碎处理，要求绞碎后的脾脏颗粒物的颗粒度达0.5~1.0cm；（b）匀浆：向绞碎后的脾脏颗粒物中，加入金刚砂、TritonX-100和浓度70~80%的柠檬酸水溶液进行匀浆，得脾脏匀浆液，且每100g脾脏颗粒物添加3~5g的金刚砂、0.1~0.5mL的TritonX-100和4~6mL的柠檬酸水溶液；其中，柠檬酸水溶液的“%”浓度是指柠檬酸与水以g/mL计量的质量/体积百分比浓度；S3、酸化：调脾脏匀浆液pH值至3.0~3.5，得脾脏匀浆酸化液；S4、冷冻、破碎解冻：（a）、采用液氮冷冻处理脾脏匀浆酸化液，得脾脏匀浆酸化液冰块；（b）、将脾脏匀浆酸化液冰块打碎，然后再进行解冻作业，解冻温度为30~37℃，作业时间为0.5~1h；（c）、收集解冻脾脏液，再按S4（a）~（b）重复1~2次；S5、离心纯化：利用自制离心纯化系统进行离心纯化，该离心纯化系统包括管式离心机、离心液储罐、动力传输组件I、动力传输组件II、动力传输组件III、一级过滤器、二级过滤器、三级过滤器及其外界附属系统；动力传输组件I由动力泵I和止回阀I串连而成；动力传输组件II由动力泵II和止回阀II串连而成；动力传输组件III由动力泵III和止回阀III串连而成；一级过滤器和二级过滤器为常规筒式过滤器；三级过滤器为自制过滤器，其结构包括筒体、中空纤维束组件、基座；筒体底部和顶部分别设有进液口和出液口，筒体外部设有夹层，夹层的上下两端分别设有夹层进口和夹层出口；中空纤维束组件包括均布有多孔的组件外壳、若干条中空纤维，这些中空纤维合并成束置于组件外壳内部；基座为圆柱体，圆柱体上段为中空呈筒状、中下段实心，基座的中下段实心上设有与中空纤维数量及其尺寸相适配的通孔；基座位于出液口下方、紧贴筒体顶壁并与其固定连接；中空纤维的上端敞口并穿设在基座的通孔内，下端封闭并与组件外壳底壁固定连接；三级过滤器的外界附属系统包括动力泵IV、止回阀IV、恒温制冷水箱，夹层出口依次串连止回阀IV、恒温制冷水箱和动力泵IV至夹层进口形成一封闭循环系统；管式离心机通过管路依次串连离心液储罐、动力泵I、止回阀I、一级过滤器、动力泵II、止回阀II、二级过滤器、动力泵III、止回阀III至三级过滤器的进液口；一级过滤器和和二级过滤器的滤芯孔径分别为4.5~5μm、0.2~0.22μm；中空纤维的截留分子量为5000~6000道尔顿；离心纯化步骤为：（a）首先将S4获得的脾脏匀浆解冻液输入管式离心机内腔中，启动该设备进行离心工作，离心转速达4000~6000rpm/min，离心20~30min；离心结束后及时将获取的离心清液转入至离心液储罐内，且该罐内温度控制范围为5~10℃；（b）启动动力泵I将上工序获得的冷却离心液经管路过止回阀I输送至一级过滤器内，输入压力0.2~0.6Mpa，实现第一次粗过滤；（c）启动动力泵II将经一级过滤器后获得的一级过滤液经管路过止回阀II输送至二级过滤器内，输入压力0.2~0.6Mpa，实现第二次粗过滤；（d）启动动力泵IV，将恒温制冷水箱内所制得的温度为5~15℃的凉水经管路从夹层进口进入夹层内，并由夹层出口经管路过止回阀IV再循环至恒温制冷水箱内；待筒体内腔温度达到5~15℃时再启动动力泵III将经二级过滤器后获得的二级过滤液经管路过止回阀III由进液口输送至三级过滤器内，输入压力0.2~0.6MPa，二级过滤液先从组件外壳上的多孔进入组件外壳内部，由于中空纤维的截留作用，二级过滤液中的杂质被挡在中空纤维的外面，而含转移因子的二级过滤液则通过中空纤维并从中空纤维顶口进入基座，然后从出液口出来，即得含转移因子的原液；S6、干燥得成品：将S5所得含转移因子的原液经真空冷冻干燥或喷雾干燥，即得成品。具体地，S1的过程为：筛选检疫合格的动物脾脏，要求脾脏新鲜、无淤血、无病变和无不良气味；然后在工作环境10万级的条件下去除脾脏的脂肪和结缔组织，同时保证脾脏完整性；再洗净脾脏渗出的血水，沥干水分；最后将脾脏浸入体积百分比浓度0.3~0.6%的甲酚水溶液中进行消毒处理，时间为20~30min，沥干备用。具体地，S2是将S1消毒沥干的脾脏分别进行绞肉和匀浆处理，操作环境均在洁净度万级的洁净房间中进行，其过程为：（a）绞肉：将消毒沥干的脾脏装入绞肉机机腔内，启动工作电源进行脾脏绞碎作业，工作速率为100~150kg/h，绞碎后脾脏颗粒物的颗粒度达0.5~1.0cm，绞碎后的脾脏颗粒物一并暂存在消过毒的塑料容器内待用；（b）匀浆：将上步获得的脾脏颗粒物投入至同房间的高速匀浆机的腔体内，再向高速匀浆机的腔体内加入金刚砂、TritonX-100和浓度70~80%的柠檬酸水溶液，每100g脾脏颗粒物添加3~5g的金刚砂、0.1~0.5mL的TritonX-100和4~6mL的柠檬酸水溶液，启动工作电源进行脾脏匀浆作业，匀浆刀片转速为9000~15000rpm/min，匀浆温度控制在32℃以下，时间为20~30min；其中，该工序中柠檬酸水溶液的“%”浓度是指柠檬酸与水以g/mL计量的质量/体积百分比浓度。具体地，S3的过程为：将脾脏匀浆液pH值调至3.0~3.5，该步骤中所使用的酸化剂为浓度15%的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脾脏源转移因子的制备方法，其特征在于，步骤如下：S1、前处理：筛选检疫合格的动物脾脏，然后去杂、清洗、消毒，沥干备用；S2、绞肉匀浆：（a）绞肉：对前处理后的脾脏进行绞碎处理，要求绞碎后的脾脏颗粒物的颗粒度达0.5~1.0cm；（b）匀浆：向绞碎后的脾脏颗粒物中，加入金刚砂、TritonX‑100和浓度70~80%的柠檬酸水溶液进行匀浆，得脾脏匀浆液，且每100g脾脏颗粒物添加3~5 g的金刚砂、0.1~0.5 mL的TritonX‑100 和4~6 mL的柠檬酸水溶液；其中，柠檬酸水溶液的“%”浓度是指柠檬酸与水以g/mL计量的质量/体积百分比浓度；S3、酸化：调脾脏匀浆液pH值至3.0~3.5，得脾脏匀浆酸化液；S4、冷冻、破碎解冻：（a）、采用液氮冷冻处理脾脏匀浆酸化液，得脾脏匀浆酸化液冰块；（b）、将脾脏匀浆酸化液冰块打碎，然后再进行解冻作业，解冻温度为30~37℃，作业时间为0.5~1h；（c）、收集解冻脾脏液，再按S4（a）~（b）重复1~2次；S5、离心纯化：利用自制离心纯化系统进行离心纯化，该离心纯化系统包括管式离心机、离心液储罐、动力传输组件I、动力传输组件II、动力传输组件III、一级过滤器、二级过滤器、三级过滤器及其外界附属系统；动力传输组件I由动力泵I和止回阀I串连而成；动力传输组件II由动力泵II和止回阀II串连而成；动力传输组件III由动力泵III和止回阀III串连而成；一级过滤器和二级过滤器为常规筒式过滤器；三级过滤器为自制过滤器，其结构包括筒体、中空纤维束组件、基座；筒体底部和顶部分别设有进液口和出液口，筒体外部设有夹层，夹层的上下两端分别设有夹层进口和夹层出口；中空纤维束组件包括均布有多孔的组件外壳、若干条中空纤维，这些中空纤维合并成束置于组件外壳内部；基座为圆柱体，圆柱体上段为中空呈筒状、中下段实心，基座的中下段实心上设有与中空纤维数量及其尺寸相适配的通孔；基座位于出液口下方、紧贴筒体顶壁并与其固定连接；中空纤维的上端敞口并穿设在基座的通孔内，下端封闭并与组件外壳底壁固定连接；三级过滤器的外界附属系统包括动力泵IV、止回阀IV、恒温制冷水箱，夹层出口依次串连止回阀IV、恒温制冷水箱和动力泵IV至夹层进口形成一封闭循环系统；管式离心机通过管路依次串连离心液储罐、动力泵I、止回阀I、一级过滤器、动力泵II、止回阀II、二级过滤器、动力泵III、止回阀III至三级过滤器的进液口；一级过滤器和和二级过滤器的滤芯孔径分别为4.5~5μm、0.2~0.22μm；中空纤维的截留分子量为5000~6000道尔顿；离心纯化步骤为：（a）首先将S4获得的脾脏匀浆解冻液输入管式离心机内腔中，启动该设备进行离心工作，离心转速达4000~6000rpm/min，离心20~30min；离心结束后及时将获取的离心清液转入至离心液储罐内，且该罐内温度控制范围为5~10℃；（b）启动动力泵I将上工序获得的冷却离心液经管路过止回阀I输送至一级过滤器内，输入压力0.2 ~0.6 Mpa，实现第一次粗过滤；（c）启动动力泵II将经一级过滤器后获得的一级过滤液经管路过止回阀II输送至二级过滤器内，输入压力0.2 ~0.6 Mpa，实现第二次粗过滤；（d）启动动力泵IV，将恒温制冷水箱内所制得的温度为5~15℃的凉水经管路从夹层进口进入夹层内，并由夹层出口经管路过止回阀IV再循环至恒温制冷水箱内；待筒体内腔温度达到5~15℃时再启动动力泵III将经二级过滤器后获得的二级过滤液经管路过止回阀III由进液口输送至三级过滤器内，输入压力0.2~0.6 MPa，二级过滤液先从组件外壳上的多孔进入组件外壳内部，由于中空纤维的截留作用，二级过滤液中的杂质被挡在中空纤维的外面，而含转移因子的二级过滤液则通过中空纤维并从中空纤维顶口进入基座，然后从出液口出来，即得含转移因子的原液；S6、干燥得成品：将S5所得含转移因子的原液经真空冷冻干燥或干燥，即得成品。...

【技术特征摘要】
1.一种脾脏源转移因子的制备方法，其特征在于，步骤如下：S1、前处理：筛选检疫合格的动物脾脏，然后去杂、清洗、消毒，沥干备用；S2、绞肉匀浆：（a）绞肉：对前处理后的脾脏进行绞碎处理，要求绞碎后的脾脏颗粒物的颗粒度达0.5~1.0cm；（b）匀浆：向绞碎后的脾脏颗粒物中，加入金刚砂、TritonX-100和浓度70~80%的柠檬酸水溶液进行匀浆，得脾脏匀浆液，且每100g脾脏颗粒物添加3~5g的金刚砂、0.1~0.5mL的TritonX-100和4~6mL的柠檬酸水溶液；其中，柠檬酸水溶液的“%”浓度是指柠檬酸与水以g/mL计量的质量/体积百分比浓度；S3、酸化：调脾脏匀浆液pH值至3.0~3.5，得脾脏匀浆酸化液；S4、冷冻、破碎解冻：（a）、采用液氮冷冻处理脾脏匀浆酸化液，得脾脏匀浆酸化液冰块；（b）、将脾脏匀浆酸化液冰块打碎，然后再进行解冻作业，解冻温度为30~37℃，作业时间为0.5~1h；（c）、收集解冻脾脏液，再按S4（a）~（b）重复1~2次；S5、离心纯化：利用自制离心纯化系统进行离心纯化，该离心纯化系统包括管式离心机、离心液储罐、动力传输组件I、动力传输组件II、动力传输组件III、一级过滤器、二级过滤器、三级过滤器及其外界附属系统；动力传输组件I由动力泵I和止回阀I串连而成；动力传输组件II由动力泵II和止回阀II串连而成；动力传输组件III由动力泵III和止回阀III串连而成；一级过滤器和二级过滤器为常规筒式过滤器；三级过滤器为自制过滤器，其结构包括筒体、中空纤维束组件、基座；筒体底部和顶部分别设有进液口和出液口，筒体外部设有夹层，夹层的上下两端分别设有夹层进口和夹层出口；中空纤维束组件包括均布有多孔的组件外壳、若干条中空纤维，这些中空纤维合并成束置于组件外壳内部；基座为圆柱体，圆柱体上段为中空呈筒状、中下段实心，基座的中下段实心上设有与中空纤维数量及其尺寸相适配的通孔；基座位于出液口下方、紧贴筒体顶壁并与其固定连接；中空纤维的上端敞口并穿设在基座的通孔内，下端封闭并与组件外壳底壁固定连接；三级过滤器的外界附属系统包括动力泵IV、止回阀IV、恒温制冷水箱，夹层出口依次串连止回阀IV、恒温制冷水箱和动力泵IV至夹层进口形成一封闭循环系统；管式离心机通过管路依次串连离心液储罐、动力泵I、止回阀I、一级过滤器、动力泵II、止回阀II、二级过滤器、动力泵III、止回阀III至三级过滤器的进液口；一级过滤器和和二级过滤器的滤芯孔径分别为4.5~5μm、0.2~0.22μm；中空纤维的截留分子量为5000~6000道尔顿；离心纯化步骤为：（a）首先将S4获得的脾脏匀浆解冻液输入管式离心机内腔中，启动该设备进行离心工作，离心转速达4000~6000rpm/min，离心20~30min；离心结束后及时将获取的离心清液转入至离心液储罐内，且该罐内温度控制范围为5~10℃；（b）启动动力泵I将上工序获得的冷却离心液经管路过止回阀I输送至一级过滤器内，输入压力0.2~0.6Mpa，实现第一次粗过滤；（c）启动动力泵II将经一级过滤器后获得的一级过滤液经管路过止回阀II输送至二级过滤器内，输入压力0.2~0.6Mpa，实现第二次粗过滤；（d）启动动力泵IV，将恒温制冷水箱内所制得的温度为5~15℃的凉水经管路从夹层进口进入夹层内，并由夹层出口经管路过止回阀IV再循环至恒温制冷水箱内；待筒体内腔温度达到5~15℃时再启动动力泵III将经二级过滤器后获得的二级过滤液经管路过止回阀III由进液口输送至三级过滤器内，输入压力0.2~0.6MPa，二级过滤液先从组件外壳上的多孔进入组件外壳内部，由于中空纤维的截留作用，二级过滤液中的杂质被挡在中...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖建设，潘慧青，张炎达，杨荣平，赵清斌，赵齐，林贺桂，
申请(专利权)人：福建贝迪药业有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35