用于梭菌转化的组合物和方法技术

本发明专利技术提供用于梭菌的组合物和方法，所述梭菌被工程化为生成工业生物产物和/或提高工业生物产物的生成效率。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关专利申请的交叉引用本申请要求于2013年6月21日提交的美国临时专利申请No.61/838,224的优先权；将该专利申请的内容以引用的方式整体并入本文。
本专利技术提供用于梭菌的基因工程的组合物和方法，所述组合物和方法用于生成工业生物产物和/或提高工业生物产物的生成效率。
技术介绍
细菌限制修饰(R-M)系统具有多种特异性和策略，但其一般功能是保护细菌免受外源DNA(例如来自噬菌体的DNA)的影响。R-M系统可由DNA甲基转移酶和限制性核酸内切酶构成。DNA甲基转移酶催化甲基从供体S-腺苷-L-甲硫氨酸(也称为“SAM”或“AdoMet”)转移到细菌宿主的特定DNA序列内的腺嘌呤或胞嘧啶残基上，该特定DNA序列被称为识别序列。根据所生成的产物的性质将DNA甲基转移酶分成三大类。第一类由催化腺嘌呤的环外氨基的甲基化以形成产物N6-甲基腺嘌呤的氨基甲基转移酶构成。第二类由催化胞嘧啶的环外氨基以形成产物N4-甲基胞嘧啶的氨基甲基转移酶构成，而第三类由使胞嘧啶环上的5-碳原子甲基化以形成5-甲基胞嘧啶的甲基转移酶构成。这些甲基化碱基在细菌R-M系统中发挥重要功能，因为它们保护宿主染色体免受伙伴限制性酶的另外有害作用，所述有害作用切割未经甲基化的识别序列DNA，但不作用于完全甲基化的DNA。因此，正是DNA甲基转移酶及其同源限制性核酸内切酶的组合作用保护细菌宿主免受任何未经修饰的外源DNA的影响。虽然R-M系统发挥着重要的保护功能，但它们还抑制菌种之间甚至相同菌种的不同菌株之间的质粒转移，因为单个细菌菌株内的多个R-M系统可全部参与限制屏障。因此，R-M系统充当了多种细菌(包括在生物技术上具有重要性的梭菌属(Clostridium))的基因操纵屏障。梭菌属由多个具有宽泛的生物化学和生理性状的菌种构成。参见Catoetal.,1986,GenusClostridium,pp.1141-1200,inP.H.Sneathetal.(eds.),Bergey’sManualofSystematicBacteriology,Vol.2,WilliamsandWilkins,Baltimore,MD(Cato等人，1986年，梭菌属，第1141-1200页，载于P.H.Sneath等人编，《伯杰氏系统细菌学手册》，第2卷，威廉斯和威尔金斯出版公司，马里兰州巴尔的摩)。归类于梭菌属的分离株需要达到四个标准：(1)能够形成内生孢子，(2)厌氧能量代谢，(3)不能发生异化硫酸盐还原作用，以及(4)具有革兰氏阳性细胞壁。参见Andressonetal.,1989,IntroductiontothephysiologyandbiochemistryofthegenusClostridium,pp.27-62,inMintonandClarke(eds.),Clostridia,PlenumPress,NewYork(Andresson等人，1989年，梭菌属的生理学和生物化学导论，第27-62页，载于Minton和Clarke编，《梭菌》，普莱南出版社，纽约)。梭菌属的产乙酸菌使用合成气作为碳源和在厌氧条件下生长的还原力。合成气由H2、CO和CO2的混合物构成，它通过从城市废物到农业副产物的任何有机材料的气化生成。由于合成气的低成本以及衍生来源的广泛性和灵活性，使用合成气作为商品酶和化学品的生物性生产的原料具有很大的吸引力。然而，相对而言，梭菌属中的产乙酸菌未得到鉴定，并且基因操纵(尤其是通过引入稳定的且不被梭菌限制性核酸内切酶切割的异源核酸来基因操纵)这些生物体的能力很大程度上未得到开发。转化梭菌的能力是梭菌有效用于生成工业生物产物(例如，异戊二烯、丁二烯和乙醇)的第一个必要和基本的步骤。克服梭菌中R-M系统的努力通常涉及在转化前体内甲基化异源DNA，以保护异源DNA不被宿主细胞中的限制性核酸内切酶降解；例如，甲基化可通过将穿梭质粒转化到表达一种或多种异源甲基转移酶(例如，来自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)噬菌体Φ3T的甲基转移酶)的菌株(例如，大肠杆菌(E.coli))而在体内进行。在分离到甲基化DNA后，可通过电穿孔、原生质体转化、接合转化、基因枪或本领域已知的其他方法将其转化到厌氧宿主细胞(例如，乙酸梭菌(Clostridiumaceticum)细胞)中。克服梭菌R-M系统的其他方法涉及使用一种或多种从商业供应商(例如，新英格兰生物实验室(NewEnglandBioLabs))商购获得的纯化甲基转移酶在体外使异源DNA甲基化，或涉及创建和使用限制修饰系统中至少一个限制性核酸内切酶基因缺失的梭菌宿主细胞。参见，例如，Dongetal.,PLoSONE20105(2):e9038(Dong等人，《科学公共图书馆ONE》，2010年，第5卷，第2期，第e9038页)。在Dong等人(2010)中，使用ClosTron基于II型内含子插入的基因敲除系统来破坏从可公开获得的丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)ATCC824基因组鉴定的推定II型限制性核酸内切酶(Cac824I)。ClosTron系统类似于大多数II型内含子方法，使用衍生自宿主范围广泛的乳乳球菌(Lactococcuslactis)LI.LtrB内含子的元件。参见，例如，Kuehneetal.,2011,ClosTron-mediatedengineeringofClostridium.MethodsinMolecularBiology,Vol.765:389-407(Kuehne等人，2011年，ClosTron介导的梭菌工程改造，《分子生物学方法》，第765卷，第389-407页)。所得的Cac824I缺失的细胞可通过电穿孔用未经甲基化的DNA(例如，未经甲基化的质粒DNA)转化。然而，这些克服梭菌限制修饰系统的方法取决于鉴定所关注的梭菌中存在的特定甲基转移酶和限制性核酸内切酶。例如，如果宿主细胞内部的限制性核酸内切酶具有与异源甲基转移酶相同的DNA识别序列，则为了用所关注的质粒转化梭菌菌种，用异源甲基转移酶(例如，用枯草芽孢杆菌噬菌体Φ3T甲基转移酶)体内或体外处理所需的质粒只能保护质粒免受切割。为了改善此类方法的有效性，可使用多种异源甲基转移酶，每种异源甲基转移酶具有不同的DNA识别序列；然而，这增加了每次转化尝试的时间和成本。如果所用的甲基转移酶不识别与所关注的梭菌细胞内部存在的限制性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列同一性，其中所述多核苷酸编码具有甲基转移酶活性的多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.06.21 US 61/838,2241.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQIDNO:1具有至少90％
的序列同一性，其中所述多核苷酸编码具有甲基转移酶活性的多
肽。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是SEQIDNO:
2。
3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述所编码的多肽在包含
CCWGG的序列处使多核苷酸甲基化。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述包含CCWGG的序列选
自CCAGG(SEQIDNO:9)和/或CCTGG(SEQIDNO:10)。
5.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述所编码的多肽在SEQID
NO:9和/或SEQIDNO:10处使多核苷酸甲基化。
6.一种包含根据权利要求1-5中任一项所述的多核苷酸的质粒，所述多
核苷酸可操作地连接至一种或多种控制序列，使得所述所编码的多
肽能够在表达宿主中表达。
7.根据权利要求6所述的质粒，其中所述表达宿主是大肠杆菌(E.
coli)。
8.根据权利要求6所述的质粒，其中所述质粒还包含SEQIDNO:14。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的质粒，其中所述质粒转化到大肠杆
菌(E.coli)S17-1细胞。
10.一种包含根据权利要求1-5所述的多核苷酸中的任一者的重组宿主细
胞。
11.一种包含根据权利要求5-8所述的质粒中的任一者的重组宿主细胞。
12.一种分离的多肽，所述多肽包含与SEQIDNO:3具有至少90％的序
列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽能够在包含CCWGG的序列
处使多核苷酸甲基化。
13.根据权利要求12所述的多肽，其中所述多肽能够在包含SEQID
NO:9和/或SEQIDNO:10的序列处使多核苷酸甲基化。
14.根据权利要求12所述的多肽，其中所述多肽能够在SEQIDNO:9
和/或SEQIDNO:10处使多核苷酸甲基化。
15.一种分离的多肽，所述多肽包含与SEQIDNO:3具有至少90％的序
列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽能够在包含CCWGG的序列
处使多核苷酸甲基化。
16.根据权利要求15所述的多肽，其中所述多肽能够在包含SEQID
NO:9和/或SEQIDNO:10的序列处使多核苷酸甲基化。
17.根据权利要求15所述的多肽，其中所述多肽能够在SEQIDNO:9
和/或SEQIDNO:10处使多核苷酸甲基化。
18.根据权利要求15所述的多肽，其中所述多肽是SEQIDNO3。
19.一种由根据权利要求1-5所述的多核苷酸中的任一者生成的分离的多
肽，其中所述多肽具有甲基转移酶活性。
20.一种生成DNA甲基转移酶的方法，所述方法包括：(a)培养重组宿主
细胞，所述重组宿主细胞包含根据权利要求1-5中任一项所述的多核
苷酸，所述培养在合适的条件下进行，以生成所述所编码的DNA甲
基转移酶，以及(b)回收所述DNA甲基转移酶。
21.一种生成重组梭菌(Clostridium)转化体的方法，所述方法包括：
将多核苷酸引入埃希氏菌(Escherichia)宿主细胞，所述多核苷酸编码
DNA甲基转移酶，
a)在适于表达所述DNA甲基转移酶的条件下培养所述埃希氏菌
(Escherichia)宿主细胞，
b)将所述甲基化的多核苷酸从所述埃希氏菌(Escherichia)宿主细胞
转移到梭菌(Clostridium)宿主细胞，其中使用该方法转化的所述
细菌选自：乙酸梭菌(Clostridiumaceticum)、杨氏梭菌
(Clostridiumljungdahlii)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium
acetobutylicum)和合成气发酵梭菌(Clostridium
autoethanogenum)。
22.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQIDNO:4具有至少90％
的序列同一性，其中所述多核苷酸编码具有核酸内切酶活性的多
肽。
23.根据权利要求22所述的多核苷酸，其中所述所编码的多肽能够在包
含CCWGG的序列处切割多核苷酸。
24.根据权利要求22所述的多核苷酸，其中所述所编码的多肽能够在包
含SEQIDNO:9和/或SEQIDNO:10的序列处切割多核苷酸。
25.根据权利要求22所述的多核苷酸，其中所述所编码的多肽能够在
SEQIDNO:9和/或SEQIDNO:10处切割多核苷酸。
26.根据权利要求22所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是SEQID
NO:4。
27.一种包含根据权利要求22-26中任一项所述的多核苷酸的质粒，所述
多核苷酸可操作地连接至一种或多种控制序列，使得所述所编码的
多肽能够在表达宿主中表达。
28.根据权利要求27所述的质粒，其中所述所编码的多肽能够在大肠杆
菌(E.coli)表达宿主中表达。
29.一种包含根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·C·斯科谢尔，D·H·韦尔斯，
申请(专利权)人：丹尼斯科美国公司，
类型：发明
国别省市：美国;US