多肽的酶促偶联制造技术

技术编号:14567128 阅读:50 留言:0更新日期:2017-02-06 00:41
本申请涉及特别是用药物对免疫球蛋白进行酶促功能化的方法。本文还公开了连接试剂、功能化抗体、医药组合物以及治疗疾病和/或病状的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2013年6月21日提交的美国临时申请号61/837,932的权益;这个临时申请以其全文引用的方式并入本文中;包括任何图式。序列表的引用本申请连同电子格式的序列表一起提交。序列表以命名为“TGase10PCT_ST25”的文件提供,于2014年6月20日创建,大小为20KB。序列表的电子格式中的信息以其全文引用的方式并入本文中。
本申请涉及化学、生物化学以及医学领域。本文公开了特别是用药物使免疫球蛋白功能化的方法。本文还公开了连接试剂、功能化抗体、医药组合物以及治疗疾病和/或病状的方法。
技术介绍
偶联至所关注的药物的免疫球蛋白,一般称为抗体药物偶联物(ADC),是治疗研究的有前景的领域。ADC技术中的新近发展已经集中于提供细胞内裂解的连接子技术,或更新近的是提供更高的体内稳定性和降低的毒性的不可裂解连接子。然而,基于不可裂解连接子的方法的可行性相比在可裂解连接子的情况下可能更加取决于细胞标靶。具有不可裂解连接子的ADC必须在细胞内内化和降解,而具有可裂解连接子的化合物可以经由细胞外药物释放和药物进入肿瘤细胞中对不良内化的标靶具活性。类似地,经由靶向抗原阳性细胞杀死旁邻抗原阴性细胞(附带的毒性)推测起来仅可能使用可裂解连接子。因此,一般据信,对于所有ADC不存在通用连接子设计并且必须独立地检查每个抗体。另外,连接至毒素的药物的功效可以例如取决于细胞类型或特定肿瘤细胞而变化,这样的话可能还有必要针对给定的标靶并且进一步与特定连接子系统组合测试多种药物。因此,ADC的发展仍然是昂贵并且耗时的过程并且在这个领域中需要改善的连接子系统。在食品工业中利用转谷氨酰胺酶(TGase)交联蛋白质的能力已有一段时间。这种利用已经避免了以定量或化学计量方式交联的需要。TGase已经显示能够偶联谷氨酰胺和赖氨酸残基,包括在抗体上(参看例如Josten等(2000)J.Immunol.Methods240,47-54;Mindt等(2008)Bioconjug.Chem.19,271-278;Jeger等(2010)Angew.Chem.Int.Ed.49:9995-9997);Kamiya等(2003)Enzyme.Microb.Technol.33,492-496和美国专利公布号2011/0184147。虽然先前对交联蛋白质的尝试已经研究了引起偶联的蛋白质基序并且鉴别出可以偶联的肽,但主导由TGase对用于修饰的谷氨酰胺残基的选择的规则仍然在很大程度上是未知的。另外,很少了解TGase处理不同底物的能力,或其对TGase以定量方式偶联的能力的影响。
技术实现思路
本公开提供了使用TGase以化学计量方式使具有不同底物的抗体上的接受体谷氨酰胺功能化的方法。本专利技术由以下发现而产生:接受体谷氨酰胺在抗体内的环境和赖氨酸衍生物供体底物的性质独立地和以组合形式都影响转谷氨酰胺酶(TGase)介导的偶联的功效。已经发现,使用与赖氨酸衍生物连接子组合的TGase使部分(例如,化学实体)偶联至抗体在最好的情况下仅提供与抗体内的接受体谷氨酰胺的部分偶联。偶联似乎尤其取决于底物的性质:虽然诸如生物素的较小、不带电和非疏水性底物可以使用已知的方法部分偶合,但诸如带电底物的一些底物根本不会偶合。疏水性和/或较大底物似乎偶合不良,导致产生抗体的异质混合物。优化偶合反应参数,但无法解决低水平偶合并且因此低水平的产品同质性的问题。大的、刚性和/或疏水性分子,特别是还含有多环或大环的那些(沿着常用细胞毒性药物的路线)可能不以高水平的完成度偶合。进一步发现,当使用在相对于接受体谷氨酰胺的+2位置处避免带负电的天冬氨酸基团的经过修饰的Fc域时可以达成大大改善的偶合。设计Fc域修饰以消除重链N297连接的糖基化,从而不需要酶促(PNGaseF)去糖基化。PNGaseF去糖基化修饰在位置297(EU索引)处天冬酰胺的侧链,其变成带负电的天冬氨酸残基。每个重链具有一个接受体谷氨酰胺(在残基295(EU索引)处)的N297S突变体的使用得到与具有N297D突变的抗体相比具有高得多的偶合的抗体组合物。此外,突变N297R、N297A以及N297S提供改善的偶联。在进一步实验中发现,当偶合疏水性和/或较大底物(在本专利技术实施例中的澳瑞他汀(auristatin)药物)时,残基297(EU编号)相比天然存在的Q295位点可能呈现对TGase更好的可接近性。特别是对于较大底物,酶和/或连接子对反应位点的可接近性可能成为可以限制偶合的因素。当偶联至每个重链在位置297处具有一个接受体谷氨酰胺的Q295X+N297Q双突变体时可以在高速率下偶合(实质上完全偶合)。可接近性对于较小底物可能是不太重要的因素,因为尸胺-丹磺酰基连接子在残基295或297上的偶合之间并未显示实质性的差异;如果有区别的话,那么尸胺-丹磺酰基显示更好地偶合至Q295上,例如,在N297A、N297S以及N297R突变体的情形中。此外,偶合环境受溶剂强烈影响。如图26和27中所展示,在TGase偶合反应混合物中高于5%或进一步10%的有机溶剂的存在强烈抑制TGase偶合至CH2域中的氨基酸上的活性。因此,在一个方面,提供偶合工艺以便调整连接子-药物部分的制剂以使得TGase偶合反应混合物中的溶剂浓度低于10%(w/w),优选地低于5%(v/v)。使用溶剂浓度很低(例如,1%)的工艺可以达成使用包含药物部分的连接子的实质上完全的直接偶合。在一个实施方案中,较小的连接子底物在残基Q295处偶合至抗体,其中Q295在+2位置(即,残基297)处由非糖基化的非天冬氨酸氨基酸残基侧接,任选地其中这个残基是丙氨酸、丝氨酸或精氨酸。优选地,偶合是通过在转谷氨酰胺酶存在下使包含接受体谷氨酰胺残基的抗体与包含伯胺的连接试剂反应来进行,其中溶剂(例如,有机溶剂、极性溶剂、非极性溶剂、DMSO)小于10%(v/v),任选地进一步小于5%、4%、3%或2%(v/v)。在一个实施方案中,大的和/或疏水性连接子底物在残基297处偶合至抗体,其中这个抗体包含N297Q突变(并且任选地进一步包含Q295X突变)。优选地,偶合是通过在转谷氨酰胺酶存在下使包含接受体谷氨酰胺残基的抗体与包含伯胺的连接试剂反应来进行,其中溶剂(例如,有机溶剂、极性溶剂、非极性溶剂、DMSO)小于10%(v/v),任选地进一步小于5%、4%、3%或2%(v/v)。在一个实施方案中,在大的和/或高度疏水性连接子底物在不存在高浓度的有机本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种使疏水性、高分子量或带电有机化合物偶联至抗体的方法,其包括以下步骤:a)提供包含接受体谷氨酰胺残基的抗体或抗体片段;b)使所述抗体与包含伯胺的连接试剂和所关注的部分(Z)反应,其中(Z)为疏水性化合物、带电有机化合物和/或具有至少500、700或800g/mol的分子量的有机化合物,在TGase存在下,在足以获得包含经由所述连接试剂连接至所述所关注的部分(Z)的接受体谷氨酰胺的抗体的条件下进行,其中所述反应混合物不含有机溶剂或含有小于10%(v/v),任选地进一步小于5%、4%、3%或2%(v/v)的有机溶剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.06.21 US 61/837,9321.一种使疏水性、高分子量或带电有机化合物偶联至抗体的方法,其包括以下步骤:
a)提供包含接受体谷氨酰胺残基的抗体或抗体片段;
b)使所述抗体与包含伯胺的连接试剂和所关注的部分(Z)反应,其中(Z)为疏水性化合
物、带电有机化合物和/或具有至少500、700或800g/mol的分子量的有机化合物,在TGase存
在下,在足以获得包含经由所述连接试剂连接至所述所关注的部分(Z)的接受体谷氨酰胺
的抗体的条件下进行,其中所述反应混合物不含有机溶剂或含有小于10%(v/v),任选地进
一步小于5%、4%、3%或2%(v/v)的有机溶剂。
2.一种使疏水性、高分子量或带电有机化合物偶联至抗体的方法,其包括以下步骤:
a)提供在重链的位置297(EU编号)处包含谷氨酰胺残基并且在位置295(EU编号)处缺
乏接受体谷氨酰胺的抗体或抗体片段;
b)使所述抗体与包含伯胺的连接试剂和所关注的部分(Z)反应,其中(Z)为疏水性化合
物、带电有机化合物和/或具有至少500、700或800g/mol的分子量的有机化合物,在TGase存
在下,在足以获得包含经由所述连接试剂连接至所述所关注的部分(Z)的接受体谷氨酰胺
的抗体的条件下进行。
3.一种使疏水性、高分子量和/或带电有机化合物偶联至抗体的方法,其包括以下步
骤:
a)提供具有至少一个接受体谷氨酰胺残基的抗体;以及
b)使所述抗体与包含伯胺的连接子和反应基团(R)反应,在TGase存在下,在足以获得
包含经由所述连接子连接至反应基团(R)的接受体谷氨酰胺的抗体的条件下进行,其中所
述反应混合物不含有机溶剂或含有小于10%(v/v)或含有小于5%、4%、3%或2%(v/v)的
有机溶剂;以及
(c)在有机溶剂存在下,任选地在至少2%、3%、4%、5%或10%(v/v)的有机溶剂存在
下,使以下反应:
(i)包含经由包含伯胺的连接子连接至反应基团(R)的接受体谷氨酰胺的步骤(b)的抗
体,与
(ii)包含所关注的部分(Z)和能够与反应基团R反应的反应基团(R′)的化合物,其中
(Z)为疏水性化合物、带电有机化合物和/或具有至少500、700或800g/mol的分子量的有机
化合物,
在足以获得包含经由包含伯胺的连接子连接至所关注的部分(Z)的接受体谷氨酰胺的
抗体的条件下进行。
4.如权利要求4所述的方法,其中抗体包含人类重链和轻链恒定区,其中所述重链恒定
区包含N297Q取代和Q295X取代,其中X为除谷氨酰胺之外的任何氨基酸。
5.如权利要求1至2或4所述的方法,其中获得式IVa的抗体或组合物。
6.如权利要求3至4所述的方法,其中获得式IVb的抗体或组合物。
7.一种抗体,其通过如前述权利要求中任一项所述的方法产生。
8.一种包含功能化接受体谷氨酰胺残基的抗体或抗体片段,其中所述接受体谷氨酰胺
残基在+2位置处由丙氨酸、组氨酸或丝氨酸侧接,所述功能化接受体谷氨酰胺残基具有式
IVa,
(Q)-NH-(C)n-X-L-(V-(Y-(Z或R)z)q)r式IVa
或其医药学上可接受的盐或溶剂化物,
其中:
Q为存在于抗体或抗体片段中的谷氨酰胺残基;
(C)n为经取代或未经取代的烷基或杂烷基链,任选地其中所述链的任何碳被烷氧基、羟
基、烷基羰氧基、烷基-S-、硫醇、烷基-C(O)S-、胺、烷基胺、酰胺或烷基酰胺取代;
n为选自2至20的范围的整数;
X为NH、O、S、不存在或键;
L独立地为不存在、键或连续的键、或在一个或多个原子处被取代的5至200个原子的含
碳构架,任选地其中所述含碳构架包含任选地在一个或多个原子处被取代的5至30个碳原
子的直链构架,任选地其中所述含碳构架为直链烃、对称或不对称支链烃、单糖、二糖、直链
或支链寡糖(不对称支链或对称支链)、其它天然直链或支链寡聚物(不对称支链或对称支
链),或由任何链增长或逐步增长聚合工艺产生的二聚物、三聚物或高碳寡聚物(直链、不对
称支链或对称支链);
r为选自1、2、3或4的整数;
q为选自1、2、3或4的整数;
z为选自1、2、3或4的整数;并且
V独立地为不存在、不可裂解的部分或可有条件地裂解的部分;
Y独立地为不存在、键或连续的键、或由1个或多个间隔子组成的间隔子系统;
R为反应部分,并且
Z为改善药物动力学特性的部分、治疗部分或诊断部分。
9.一种在重链的位置297(EU编号)处包含功能化接受体谷氨酰胺残基并且在位置295
(EU编号)处缺乏接受体谷氨酰胺的抗体或抗体片段,所述功能化接受体谷氨酰胺残基具有
式IVa,
(Q)-NH-(C)n-X-L-(V-(Y-(Z)z)q)r式IVa
或其医药学上可接受的盐或溶剂化物,
其中:
Q为存在于抗体或抗体片段中的谷氨酰胺残基;
(C)n为经取代或未经取代的烷基或杂烷基链,任选地其中所述链的任何碳被烷氧基、羟
基、烷基羰氧基、烷基-S-、硫醇、烷基-C(O)S-、胺、烷基胺、酰胺或烷基酰胺取代;
n为选自2至20的范围的整数;
X为NH、O、S、不存在或键;
L独立地为不存在、键或连续的键、或在一个或多个原子处被取代的5至200个原子的含
碳构架,任选地其中所述含碳构架包含任选地在一个或多个原子处被取代的5至30个碳原
子的直链构架,任选地其中所述含碳构架为直链烃、对称或不对称支链烃、单糖、二糖、直链
或支链寡糖(不对称支链或对称支链)、其它天然直链或支链寡聚物(不对称支链或对称支
链),或由任何链增长或逐步增长聚合工艺产生的二聚物、三聚物或高碳寡聚物(直链、不对
称支链或对称支链);
r为选自1、2、3或4的整数;
q为选自1、2、3或4的整数;
z为选自1、2、3或4的整数;并且
V独立地为不存在、不可裂解的部分或可有条件地裂解的部分;
Y独立地为不存在、键或连续的键、或由1个或多个间隔子组成的间隔子系统;并且
Z为改善药物动力学特性的部分、治疗部分或诊断部分,其中Z为带负电、疏水性和/或
具有至少400g/mol的分子量的有机化合物。
10.如权利要求9所述的抗体,其中所述抗体在所述位置295处具有除天冬酰胺之外的
氨基酸。
11.如权利要求9所述的抗体,其中所述抗体在所述位置295处具有丝氨酸、丙氨酸、...

【专利技术属性】
技术研发人员:D·贝尔根P·丹勒C·贝尔蒙特L·戈捷F·罗马涅E·费舍尔R·斯科博勒
申请(专利权)人:先天制药公司保罗·谢勒研究所
类型:发明
国别省市:法国;FR

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