一种高质量果实基因组DNA的提取方法及提取试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种高质量的果实的基因组DNA的提取方法，属于分子生物领域。本发明专利技术提供的提取方法包括对葡萄果实的液氮研磨、DNA抽提、沉淀杂质以及DNA的纯化。采用本发明专利技术提供的提取方法能够有效的去除葡萄果实样本中富含的多糖、多酚等次生代谢产物，从而获得高质量的葡萄果实基因组DNA。本发明专利技术提供的提取方法主要应用于基因检测领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种高质量果实基因组DNA的提取方法，特别是一种高质量葡萄果实基因组DNA的提取方法及提取试剂盒，属于基因组学领域，可用于基因检测领域。
技术介绍
DNA的提取是分子生物学研究的基础技术，提取高纯度及结构完整的DNA是构建基因文库和遗传图库等分子生物学研究的前提。传统的DNA提取与纯化，如CTAB法、SDS法是在裂解细胞的基础上，多次Tris饱和苯酚、氯仿等有机溶剂抽提使蛋白质变性沉淀于有机相，而核酸保留在水相，达到分离核酸的目的；加入RNA酶除去核酸中的RNA；然后加入异丙醇、乙醇等沉淀DNA；用70％乙醇漂洗沉淀，除去分离过程中残留的有机溶剂和盐离子，以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应，最后用TE溶解DNA备用。但是有些情况下，由于组织材料的外在性质不同以及化学成分、组织结构等内在特点的差异，在提取基因组DNA时需要选择不同的方法或作一些特殊的处理。葡萄果实的基因组DNA提取过程中，就因其富含多糖、多酚、单宁、色素及其它次生代谢物质，从而导致提取出的DNA由于多酚被氧化成棕褐色，多糖、单宁等物质与DNA会结合成粘稠的胶状物，获得的DNA常出现产量低、纯度差、易降解，影响了DNA质量，不能被限制性内切酶酶切，严重的甚至不能作为模板进行PCR扩增。
技术实现思路
由于葡萄果实材料的特殊性，为了克服现有技术的不足，得到便于构建基因文库或遗传图库等分子生物学研究利用的高质量的基因组DNA，本专利技术提供了一种果实的高质量的基因组DNA的提取方法。本专利技术以葡萄果实作为提取材料，采用优化改进的CTAB法进行提取，获得了高质量的葡萄果实的基因组DNA。本专利技术人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：通过优化抽提步骤，并调整裂解试剂和提取试剂的组分和各组分的配比，能够实现适用于果实样本、尤其是葡萄果实的高质量的基因组DNA的提取方法，从而完成了本专利技术。即本专利技术包括：1.一种葡萄果实的基因组DNA的提取方法，包括如下步骤：步骤A：将样本置于液氮中进行研磨，得到研磨样本；步骤B：将所述研磨样本置于裂解液中进行裂解，得到裂解产物；步骤C：将所述裂解产物置于第一提取液中进行抽提，得到第一抽提产物；步骤D：将所述第一抽提产物进行RNA酶消化，得到RNA酶消化产物；步骤E：将所述RNA酶消化产物进行蛋白酶K消化，得到蛋白酶K消化产物；步骤F：将所述蛋白酶K消化产物置于第二提取液中进行抽提，得到第二抽提产物；步骤G：将所述第二抽提产物中置于异丙醇中进行沉淀，其中，所述第一提取液由氯仿和异戊醇组成，所述氯仿和异戊醇的体积比为24:1；所述第二提取液由Tris饱和苯酚、氯仿和异戊醇组成，所述Tris饱和苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1。2.根据项1所述的提取方法，其特征在于，所述裂解液的组分为：2％(g/v，即质量/体积)的CTAB、pH为8的100mM的Tris-HCl缓冲液、1.4M的NaCl溶液、20mM的EDTA、4％(g/v，即质量/体积)的PVP、0.5体积％的β-巯基乙醇。3.根据项1或2任一项所述的提取方法，其特征在于，所述步骤G后还包括步骤G-1：将目标基因组DNA进行纯化。4.根据项1～3任一项所述的提取方法，其特征在于，所述步骤C、步骤F和/或步骤G后还包括步骤H：将所述各步产物进行离心。5.根据项1～4任一项所述的提取方法，其特征在于，所述葡萄果实为新鲜果实。6.一种果实的基因组DNA的提取试剂盒，其特征在于，包括样本裂解试剂，第一提试剂，第二提取试剂，助沉试剂和纯化试剂，其中，所述样本裂解试剂包括CTAB、Tris-HCl溶液、NaCl、EDTA、PVP、β-巯基乙醇，所述第一提取试剂包括氯仿和异戊醇，所述第二提取试剂包括Tris饱和苯酚、氯仿和异戊醇。7.一种项1-5任一项所述提取方法或项6所述提取试剂盒在提取葡萄果实基因组DNA中的应用。8.根据项7所述的应用，其特征在于，所述葡萄果实为新鲜果实。9.一种用于二代测序的果实DNA文库构建方法，包括如下步骤：步骤a：采用权利要求1-5任一项所述提取方法提取得到葡萄果实的基因组DNA；步骤b：将所述葡萄果实的基因组DNA打断到希望进行测序的长度，得到希望进行测序的DNA片段；步骤c：将希望进行测序的DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段；步骤d：将所述平末端DNA片段进行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段；步骤e：将所述3'端加A的DNA片段加接头，得到加接头DNA片段；和步骤f：将所述加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：通过实施本专利技术记载的葡萄果实的基因组DNA的提取方法，能够得到高质量的果实基因组DNA，特别是葡萄果实的基因组DNA。在本说明书中，本专利技术记载的高质量基因组DNA中的“高质量”是指基因组DNA的纯度和浓度高。纯度高即OD260/280介于1.6～1.8之间，OD260/230介于2.0～3.2之间。例如核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质的最大吸收波长为280nm，可以通过测定在260和280的OD比值来评价核酸的纯度。浓度高即每单位体积液体中所含的基因组DNA含量高，例如，在100mg的样本起始量下，提取得到的基因组DNA的浓度不低于30ng/μL，基因组DNA的总量不低于1μg。附图说明图1是本专利技术的实施例1的琼脂糖凝胶电泳图，其中M1—分子量标准，1—编号1的样本，2—编号2的样本；图2是本专利技术的对比例1的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M1—分子量标准，3—编号3的样本，4—编号4的样本。具体实施方式本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突以本说明书中的定义为准。在一个方面，本专利技术提供了一种果实的基因组DNA的提取方法，包括如下步骤：步骤A：将样本置于液氮中进行研磨，得到研磨样本；步骤B：将所述研磨样本置于裂解液中进行裂解，得到裂解产物；步骤C：将所述裂解产物置于第一提取液中进行抽提，得到第一抽提产物；步骤D：将所述第一抽提产物进行RNA酶消化，得到RNA酶消化产物；步骤E：将所述RNA酶消化产物进行蛋白酶K消化，得到蛋白酶K消化产物；步骤F：将所述蛋白酶K消化产物置于第二提取液中进行抽提，得到第二抽提产物；步骤G：将所述第二本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葡萄果实的基因组DNA的提取方法，包括如下步骤：步骤A：将样本置于液氮中进行研磨，得到研磨样本；步骤B：将所述研磨样本置于裂解液中进行裂解，得到裂解产物；步骤C：将所述裂解产物置于第一提取液中进行抽提，得到第一抽提产物；步骤D：将所述第一抽提产物进行RNA酶消化，得到RNA酶消化产物；步骤E：将所述RNA酶消化产物进行蛋白酶K消化，得到蛋白酶K消化产物；步骤F：将所述蛋白酶K消化产物置于第二提取液中进行抽提，得到第二抽提产物；步骤G：将所述第二抽提产物中置于异丙醇中进行沉淀,其中，所述第一提取液由氯仿和异戊醇组成，所述氯仿和异戊醇的体积比为24:1；所述第二提取液由Tris饱和苯酚、氯仿和异戊醇组成，所述Tris饱和苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1。

【技术特征摘要】
1.一种葡萄果实的基因组DNA的提取方法，包括如下步骤：
步骤A：将样本置于液氮中进行研磨，得到研磨样本；
步骤B：将所述研磨样本置于裂解液中进行裂解，得到裂解产物；
步骤C：将所述裂解产物置于第一提取液中进行抽提，得到第一抽提产物；
步骤D：将所述第一抽提产物进行RNA酶消化，得到RNA酶消化产物；
步骤E：将所述RNA酶消化产物进行蛋白酶K消化，得到蛋白酶K消化产
物；
步骤F：将所述蛋白酶K消化产物置于第二提取液中进行抽提，得到第二抽
提产物；
步骤G：将所述第二抽提产物中置于异丙醇中进行沉淀,
其中，
所述第一提取液由氯仿和异戊醇组成，所述氯仿和异戊醇的体积比为24:1；
所述第二提取液由Tris饱和苯酚、氯仿和异戊醇组成，所述Tris饱和苯酚、
氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述裂解液的组分为：
2％的CTAB、pH为8的100mM的Tris-HCl缓冲液、1.4M的NaCl溶液、20mM
的EDTA、4％的PVP、0.5体积％的β-巯基乙醇。
3.根据权利要求1或2任一项所述的提取方法，其特征在于，所述步骤G
后还包括步骤G-1：将目标基因组DNA进行纯化。
4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述步骤C、步骤F和/
或步骤G后还包括步骤H：...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏少华，童育，玄兆伶，李大为，梁峻彬，陈重建，
申请(专利权)人：安诺优达基因科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11