一类防御素-白蛋白的抗肿瘤融合蛋白及其制备和应用制造技术

技术编号:14562778 阅读:130 留言:0更新日期:2017-02-05 19:32
本发明专利技术涉及一类防御素-白蛋白的抗肿瘤融合蛋白,其包含以下结构:防御素HBD2-连接肽(G4S)2-人血清白蛋白HSA;其中所述的人β防御素2(HBD2)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,所述人血清白蛋白HSA具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,所述新型抗肿瘤融合蛋白,具有白蛋白巨胞饮靶向性和防御素HBD-2杀伤肿瘤细胞的功能,有望开发成为一类新型抗肿瘤药物。

【技术实现步骤摘要】

:本专利技术属于药用蛋白
,具体而言,涉及一类防御素-白蛋白的抗肿瘤融合蛋白及其制备和应用
技术介绍
:临床常用的抗肿瘤药物以化疗药物为主,但由于其具有选择性低、副作用大等缺点,其应用受到诸多限制;靶向抗肿瘤药物由于其选择性高、毒副作用小,在肿瘤靶向治疗方面取得了巨大的成就,但依然存在不少问题,影响了临床治疗效果,如靶向效率低、易产生肿瘤的耐药性、免疫反应等安全性问题。因此,继续寻找更加安全高效的抗肿瘤靶向药物,是抗肿瘤药物研发需要解决的重要课题。巨胞饮(macropinocytosis)是一种高度保守的内吞形式,指在某些因素刺激下,细胞膜皱褶形成大且不规则的原始巨胞饮体,其直径一般为0.5-3μm,比蛋白包被的内吞作用的囊泡平均尺寸大30倍。它为快速高效地内吞细胞外营养物质和液相大分子提供了一条有效途径。巨胞饮在肿瘤细胞中广泛存在,是癌细胞推动自身增值和生长的重要营养物质传递途径,正常细胞不存在或存在较少。Ras、Src等一些致癌基因的突变均可以激活巨胞饮,大部分的肺癌、结肠癌及超过90%的胰腺癌为KRAS突变型。研究表明,Ras癌细胞尤其依赖于巨胞饮维持生长和生存,它利用巨胞饮过程,吞噬白蛋白(albumin),并随后利用其生成生长必需氨基酸的机制,来满足其特殊营养需求。阻断巨胞饮摄取白蛋白途径,肿瘤即停止生长。因此,有效地利用巨胞饮这一独特肿瘤细胞“进食机制”作为治疗靶点,设计抗肿瘤药物,可以提高药物的选择性和输送效率。人血清白蛋白(Humanserumalbumin,HSA)是由585个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质,分子量大约为68kDa,是血液中含量最高的蛋白,无免疫原性,人体相容性好,所以选择白蛋白作为药物传输载体具有较多优点;另外,巨胞饮是白蛋白进入肿瘤细胞的主要途径,一些肿瘤细胞巨胞饮明显增强,并以白蛋白为主要营养来源,为其提供生长必需氨基酸。所以,可以利用白蛋白作为靶向巨胞饮的药物输送载体。防御素(defensins)是一类富含半胱氨酸,含有β片层折叠结构的阳离子小分子多肽,分子量为4.0kDa-5.0kDa,通过6个或8个半胱氨酸残基形成3个或4个分子内二硫键维持其β片层结构的稳定性。防御素广泛存在于哺乳动物、昆虫及植物体内,是一种具有抗菌、抗病毒及抗肿瘤活性的天然抗微生物肽。人的防御素(humandefensin)是由粒细胞和上皮细胞产生的,从遗传学上分为α-防御素和β-防御素家族。它们在天然免疫方面主要表现为杀死病原微生物和带有包膜的病毒,而在获得性免疫方面,主要表现作为化学诱导剂和激活免疫细胞。它是机体天然免疫系统的重要组成部分,具有很强的抗菌、抗病毒及肿瘤细胞毒作用,其作用机制较为相似,都是通过细胞裂解的作用。防御素作为一种天然抗肿瘤活性多肽与传统的化疗药相比,具有不良反应小,不易产生耐药性等优点。研究表明,人防御素可以作为一种新的治疗癌症的抗肿瘤分子。人β防御素2(Humanbetadefensin2,HBD2)属于人β防御素家族具有代表性的成员之一,对肿瘤细胞的毒性是以细胞裂解为主,伴有少量的细胞凋亡。新的研究表明,在一些癌细胞中,HBD-2可以作为肿瘤的抑癌基因,如诱导口腔鳞癌细胞中HBD2的高表达,能够有效抑制人口腔鳞癌细胞株SAS的增值和侵袭,对A431和M-HeLa肿瘤细胞株的生存活力和增殖能力有很大影响。另外,HBD2可趋化未成熟的树突状细胞和记忆性T细胞,增强免疫系统对肿瘤抗原的识别,也可促进体内免疫因子的分泌活化,从而增进机体对肿瘤细胞的免疫监视,在肿瘤免疫中发挥一定的作用。在小鼠结肠癌细胞CT26移植瘤模型中,HBD2基因治疗可以介导特异性抗肿瘤免疫,增强局部的抗肿瘤作用。表明,HBD2在肿瘤免疫治疗方面成为有前景的应用分子。基于上述,本专利技术制备一类融合蛋白,是由人防御素,包括α-防御素和β-防御素家族、连接肽、人血清白蛋白组成。本专利技术具体选择防御素家族中有代表性的人β防御素2(HBD2)作为杀伤肿瘤细胞的“弹头”分子,有巨胞饮靶向性的白蛋白作为药物的输送载体,研制得到防御素-白蛋白的抗肿瘤融合蛋白HBD2-HSA(defensinintegratedalbumin,DIA)。所述融合蛋白具有巨胞饮靶向性、防御素杀伤肿瘤细胞的功能、无免疫原性和不易产生耐药性特征,迄今尚未见有国内外的相关报道。
技术实现思路
:本专利技术的目的之一是,提供一类靶向巨胞饮的防御素-白蛋白抗肿瘤融合蛋白。本专利技术的目的之二是,提供了所述融合蛋白的制备方法。本专利技术的目的之三是,提供防御素-白蛋白的抗肿瘤融合蛋白及其药物组合物在肿瘤治疗中的用途。研究表明,防御素作为一种阳离子多肽,其活性明显受到白蛋白的影响,随着白蛋白浓度的增高其活性逐渐丧失,由于血液中白蛋白含量较高,这一特点限制了防御素作为治疗药物在体内的应用;另一方面,由于防御素本身对表达宿主有毒害作用,多以无活性形式表达或者不表达,限制了其生产应用。本专利技术,将防御素与白蛋白融合在一起,旨在利用白蛋白被肿瘤细胞巨胞饮大量内吞的特点,将防御素带入癌细胞内发挥作用。白蛋白作为癌细胞的供能对象,会很快降解,而防御素含有三对二硫键,且分子量较小,比较稳定,有希望在肿瘤细胞内攻击其细胞器。这一设计,不仅获得了DIA的宿主高表达,降低了制备难度,且提高了防御素的靶向性,其对正常细胞的毒性大大降低,另外还为防御素作为杀伤肿瘤细胞的“弹头”分子提供了一种新探索。本专利技术通过基因工程技术构建基于HSA,同时融合了HBD2(defensinintegratedalbumin,DIA)的重组载体,并通过毕赤酵母分泌表达系统制备目的蛋白,经纯化及相关的活性评价,获得一种抗肿瘤融合蛋白,有效避免原核表达系统中包涵体复性的不利因素,更好地确保其生物学活性。本专利技术提供一种抗肿瘤融合蛋白,其中,所述的人β防御素2(HBD2)具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列,共41个氨基酸;所述人血清白蛋白HSA具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列,共585个氨基酸。此外,人β防御素2(HBD2)与HSA之间的连接肽,共10个氨基酸,具有SEQIDNO:3所示氨基酸序列。所述融合蛋白具有以下结构排列:防御素HBD2-连接肽(G4S)2-人血清白蛋白HSA,或HSA-(G4S)2-HBD2;所述蛋白具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列,或者相应的HSA(SEQIDNO:2)-(G4S)2(SEQIDNO:3)-HBD2(SEQIDNO:1)氨基酸序列。所述融合蛋白的编码基因,具有SEQIDNO:5所示核苷酸序列,或相应于编码HSA(SEQIDNO:2)-(G4S)2(SEQIDNO:3)-HBD2(SEQIDNO:1)氨基酸序列的核苷酸序列。其中,所述融合蛋白的防御素不限于人β防御素HBD2,包括所有的人α防御素和人β防御素,本专利技术选择比较有代表性的人防御素HBD2。本专利技术还提供了所述融合蛋白的制备方法。所述方法是,将一类防御素如HBD2,通过连接肽,如(G4S)2以及HSA基因序列,加入合适的酶切位点以及利于蛋本文档来自技高网
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【技术保护点】
一类靶向巨胞饮的防御素‑白蛋白抗肿瘤融合蛋白,其特征是,所述融合蛋白系由人防御素、连接肽、人血清白蛋白组成并具有以下结构:防御素HBD2‑连接肽(G4S)2‑人血清白蛋白HSA,或者人血清白蛋白HSA‑连接肽(G4S)2‑防御素HBD2。

【技术特征摘要】
1.一类靶向巨胞饮的防御素-白蛋白抗肿瘤融合蛋白,其特征是,所述融合蛋白系由人
防御素、连接肽、人血清白蛋白组成并具有以下结构:
防御素HBD2-连接肽(G4S)2-人血清白蛋白HSA,或者人血清白蛋白HSA-连接
肽(G4S)2-防御素HBD2。
2.权利要求1所述的融合蛋白,其特征是,所述防御素不限于人β防御素HBD2,包括
所有的人α防御素和人β防御素家族成员,优选人β防御素HBD2。
3.权利要求1所述的融合蛋白,其特征是,所述的人β防御素2(HBD2)具有SEQID
NO:1所示的氨基酸序列;所述人血清白蛋白HSA具有SEQIDNO:2所示的氨基酸
序列;所述连接肽(G4S)2为(GGGGS)2,具有SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。
4.权利要求1所述的融合蛋白,其特征是,所述融合蛋白具有SEQIDNO:1-SEQID:
NO:3-SEQID:NO:2即SEQIDNO:4所示的氨基酸序列,或者具有SEQID
NO:2-NO:3-NO:1所示的氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员:杜玥甄永苏尚伯杨盛唯瑾李毅张胜华刘秀均
申请(专利权)人:中国医学科学院医药生物技术研究所
类型:发明
国别省市:北京;11

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