一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法技术

一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，包括步骤S1，确定细胞无毒浓度：分组在细胞培养体系中加入不同种类、不同浓度的植物乙醇提取物，以选取几组实验浓度中对细胞无毒影响的植物乙醇提取物；S2：病毒感染：将获得的对细胞无毒影响的植物乙醇提取物加入细胞中，使病毒感染细胞，S3：荧光素酶检测：通过测定荧光素酶活力反映病毒的增值情况，从而筛选出抗病毒植物乙醇提取物。其优点是：通过荧光素酶检测原理，采用病毒IBV-3ab-luc、感染细胞H1299作为原材料，简单、有效地筛选出抗病毒能力强的植物乙醇提取物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体地说是一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法。
技术介绍
现有筛选方法主要是通过将乙醇提取物加入感染细胞，使病毒感染细胞。一定时间后观察细胞的形态，如细胞病变的情况，只能定性地了解抗病毒效果，而不能定量。
技术实现思路
为了克服上述技术缺陷，本专利技术提供筛选方便且抗病毒能力强的一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法。本专利技术提供了一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，包括步骤S1，确定细胞无毒浓度：分组在细胞培养体系中加入不同种类、不同浓度的植物乙醇提取物，以选取各组中对细胞无毒影响的植物乙醇提取物；S2：病毒感染：将获得的对细胞无毒影响的植物乙醇提取物加入细胞中，使病毒感染细胞，S3：荧光素酶检测：通过测定荧光素酶活力反映病毒的增值情况，从而筛选出抗病毒植物乙醇提取物。本专利技术一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，其优点是：通过荧光素酶检测原理，采用病毒IBV-3ab-luc、感染细胞H1299作为原材料，简单、有效地筛选出抗病毒能力强的植物乙醇提取物。具体实施方式本专利技术提供了一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，包括步骤S1，确定细胞无毒浓度：分组在细胞培养体系中加入不同种类、不同浓度的植物乙醇提取物，以选取几组实验浓度中对细胞无毒影响的植物乙醇提取物；S2：病毒感染：将获得的对细胞无毒影响的植物乙醇提取物加入细胞中，使病毒感染细胞，S3：荧光素酶检测：通过测定荧光素酶活力反映病毒的增值情况，从而筛选出抗病毒植物乙醇提取物。下面结合实例对本专利技术进行详细描述，当然所描述的实施例仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本专利技术中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术的保护范围。优选地，一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，包括以下步骤：步骤S1，确定细胞无毒浓度：将至少一种植物乙醇提取物分别用75％～85％的乙醇做溶剂，再等倍稀释成至少一个浓度，放入3°～5°冰箱中备用；培养至少一组细胞，将稀释好的植物乙醇提取物加入细胞中，作为对照组，放入细胞培养箱，48～52小时后，在倒置显微镜下观察经不同浓度的植物乙醇提取物处理后的细胞的形态变化；若细胞轮廓变形，粗糙，或聚合脱落视为该浓度的植物乙醇提取物对细胞有毒害，从而选取几组实验浓度中对细胞无毒影响的植物乙醇提取物。进一步地，培养细胞具体操作为：在12孔板中均用RPMI-1640培养液培养细胞H1299，且每孔的培养液体积为0.8～1.2mL；加入每孔细胞中的植物乙醇提取物的量为4.8～7.2ul。进一步地，待细胞铺满培养板底部80％时，再将稀释后的植物乙醇提取物加入细胞；进一步地，选取的每种植物的每个浓度至少对应一组细胞。优选地，一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，包括以下步骤：包括步骤S2，病毒感染：待多组孔板中细胞的覆盖达到80％至90％时，分别加入步骤S1中获得的植物乙醇提取物，且此植物乙醇提取物的浓度对细胞无毒影响；放入培养箱，24h后，用病毒感染细胞；进一步地，每孔细胞中加入的植物乙醇提取物为4.8～7.2ul；优选地，所述病毒为携带有荧光素酶基因的重组病毒IBV-3ab-luc；且每孔病毒的加入量为80～120ul；所述细胞为人肺癌细胞H1299。优选地，一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，包括以下步骤：包括步骤S3，荧光素酶检测：病毒感染细胞24h后，去上清液、洗涤，然后每孔加入细胞裂解液RLB100～120ul；刮下细胞后冻融，将细胞液转移至一无菌EP管中，涡旋、离心，取上清液至另一无菌EP管中，加入底物荧光素15～25ul，充分混合后，放入化学发光检测器中检测，至少读数3次，取平均值，最后将溶剂对照与各处理的数值相比，数量级大，表明植物乙醇提取物的抗病毒能力强，反之，则弱。进一步地，所述洗涤采用1mL的PBS对每孔清洗2～5次；进一步地，用枪头刮下细胞，再冻融一次；进一步地，所述涡旋时间为15～18s，离心条件为10000rpm，2min；所取上清液15～25ul至另一新EP管中。下面结合具体实施例为本专利技术作进一步说明：实施例一：一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，包括如下步骤：步骤S1，确定细胞无毒浓度：分别选用75％乙醇浸泡麦冬根、枸杞果、车前叶、三七叶7d以上，获取麦冬根、枸杞果、车前叶、三七叶的乙醇提取物(提取方法为常规方法，在广口瓶中，压紧植物材料，根据植物的体积，以80％乙醇刚好完全淹没植物材料为标准，根据植物质量和乙醇体积，确定初始浓度分别为2.7240g/mL、3.0272g/mL、1.6080g/mL和1.8632g/mL)，将获得的4种乙醇提取物分别再用80％乙醇做溶剂等倍(2X)稀释成5个浓度(具体如下表1所示)，放入4°冰箱中备用；在12孔板中均用RPMI-1640培养液培养细胞H1299，且每孔的培养液体积为1.2mL；待细胞H1299铺满培养板底部80％时，每孔加入7.2ul稀释好的植物乙醇提取物至细胞H1299中(保证细胞液中乙醇浓度为0.48％，前期试验得出此浓度对细胞没有影响)，放入细胞培养箱，48小时后，在倒置显微镜下观察各浓度提取物处理后细胞H1299的形态变化；若细胞轮廓变形，粗糙，或聚合脱落视为该浓度的植物乙醇提取物对细胞H1299有毒害，依此确定植物乙醇提取物的最大无毒浓度，结果如下表：表1四种植物乙醇提取物不同浓度处理细胞H129924h后细胞的形态变化由表1数据看出：麦冬根、枸杞果、车前叶和三七叶的最大无毒浓度分别为0.3405g/mL、0.3784g/mL、0.4020g/mL和0.9316g/mL，后续用该浓度进行试验。S2：病毒感染：待孔板中细胞的覆盖达到80％至90％时，向各孔细胞H1299中加入7.2ul步骤S1获得的最大无毒浓度的植物乙醇提取物，进行对照；放入培养箱，24h后，用120ul携带有荧光素酶基因的重组病毒IBV-3ab-luc(MOI＝0.1)感染每孔中的人肺癌细胞H1299；S3，荧光素酶检测：病毒感染细胞24h后，去上清液,用1mL的PBS每孔清洗4次，然后每孔加入细胞裂解液RLB120ul；用枪头充分刮下细胞H1299后冻融一次，将细胞液转移至一无菌EP管中，涡旋15s，用10000rpm离心2min，取25ul上清液至另一无菌EP管中，加入底物荧光素25ul，充分混合后，迅速放入化学发光检测器中检测，读取数据3次，取平均值。抗病毒能力评价的标准：本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1，确定细胞无毒浓度：分组在细胞培养体系中加入不同种类、不同浓度的植物乙醇提取物，以选取各组中对细胞无毒影响的植物乙醇提取物；S2：病毒感染：将获得的对细胞无毒影响的植物乙醇提取物加入细胞中，使病毒感染细胞，S3：荧光素酶检测：通过测定荧光素酶活力反映病毒的增值情况，从而筛选出抗病毒植物乙醇提取物。

【技术特征摘要】
1.一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，确定细胞无毒浓度：分组在细胞培养体系中加入不同种类、不同浓度的植物乙醇提取物，以选取各组中对细胞无毒影响的植物乙醇提取物；S2：病毒感染：将获得的对细胞无毒影响的植物乙醇提取物加入细胞中，使病毒感染细胞，S3：荧光素酶检测：通过测定荧光素酶活力反映病毒的增值情况，从而筛选出抗病毒植物乙醇提取物。
2.根据权利要求1所述的一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，其特征在于：包括
步骤S1，确定细胞无毒浓度：将至少一种植物乙醇提取物分别用75％～85％的乙醇做溶剂，再等倍稀释成至少一个浓度，放入3°～5°冰箱中备用；培养至少一组细胞，将稀释好的植物乙醇提取物加入细胞中，作为对照组，放入细胞培养箱，48～52小时后，在倒置显微镜下观察经不同浓度的植物乙醇提取物处理后的细胞的形态变化；若细胞轮廓变形，粗糙，或聚合脱落视为该浓度的植物乙醇提取物对细胞有毒害，从而选取几组实验浓度中对细胞无毒影响的植物乙醇提取物。
3.根据权利要求2所述的一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，其特征在于：所述培养感染细胞具体操作为：在12孔板中均用RPMI-1640培养液培养细胞H1299，且每孔的培养液体积为0.8～1.2mL；加入每孔细胞中的植物乙醇提取物的量为4.8～7.2ul。
4.根据权利要求2所述的一种筛选抗病毒植物乙醇提取物的方法，其特征在于：选取的每种植物的每个浓度至少对应一组细胞。
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【专利技术属性】
技术研发人员：王真，
申请(专利权)人：长江大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42