一种EpCAM抗体免疫磁珠及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种EpCAM抗体免疫磁珠及其制备方法，包括磁性微球部分和抗体部分，所述免疫磁珠的结构式为：A‑NH‑N＝CH‑B，其中A表示磁性微球，B表示EpCAM抗体，或者A表示EpCAM抗体，B表示磁性微球。将本发明专利技术的免疫磁珠用于捕获CTC，不仅特异性、敏感性好，而且磁响应迅速、富集时间短，捕获效率高。而且免疫磁珠的性质稳定，同时粒径小，磁响应性好，分散性好。并且制备方法简单，具有很强的实用性。

EpCAM antibody immune magnetic bead and preparation method thereof

The invention provides a EpCAM antibody immunomagnetic beads and preparation method thereof, including magnetic microspheres and antibody, structure the immunomagnetic beads: A N = CH NH B, which A said magnetic microspheres, B said EpCAM antibody, EpCAM antibody or A said, B said magnetic microspheres. The immune magnetic beads of the invention are used for capturing the CTC, and the utility model has the advantages of good specificity and sensitivity, fast magnetic response, short enrichment time and high trapping efficiency. Moreover, the magnetic properties of the magnetic beads are stable, the particle size is small, the magnetic response is good, and the dispersion is good. The preparation method is simple and has strong practicability.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫磁珠的制备领域，具体地说是一种EpCAM抗体免疫磁珠及其制备方法。
技术介绍
EpCAM(表皮细胞粘附分子)是一个跨膜糖蛋白介导的钙离子非依赖性同型细胞-细胞粘连。EpCAM也参与细胞信号，迁移，增殖和分化。另外，EpCAM能上调c-myc，e-fabp和周期素。由于EpCAM在上皮和上皮来源的肿瘤完全表达，EpCAM可以用作各种诊断标记癌症，尤其在循环肿瘤细胞的鉴定上。EpCAM在肿瘤发生和癌转移中发挥了重要的作用，因此它也可以作为一个潜在的预后标记，作为用于免疫治疗策略的潜在目标。循环肿瘤细胞(CTC)是指自发或因诊疗操作由实体瘤原发灶或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，一般以单个细胞或细胞团(又称循环肿瘤微栓子，CTM)的形式存在于循环系统中。转移是癌症相关死亡的主要原因，而CTC被视为转移的种子，在新的肿瘤生物标志物的发现、肿瘤预后判断及个体化治疗方面存在很大的应用潜力，是国内外肿瘤研究的热点之一。然而，CTC在外周血中的浓度非常低，通常在约109个血细胞中仅有数个CTC，大约每105～107个单核细胞中才有几个循环肿瘤细胞。因此，从复杂血液样本中准确、高效地将CTC分选出来，需要很高的捕获率和敏感度。现有的捕获和富集CTC的方法主要有基于CTC的物理性状进行捕获，如密度、分子大小等物理性状，或基于CTC表面生物标识物如EpCAM(上皮细胞粘着分子)等进行富集。基于密度、分子大小等物理性质对CTC进行捕获，容易导致CTC漏筛，得到假阴性结果。基于CTC表面生物标识物的免疫磁珠富集则是目前应用最为广泛的CTC捕获方式之一，其操作容易，捕获效率高，应用前景好。但目前市面上大多用微米级(1200-4500nm)的免疫磁球捕获CTCs，此大小的免疫磁球进行磁分离时容易对细胞造成机械压力，影响细胞的生物学功能和活性，不利于后续分析和培养。而且由于捕获的CTCs还需要经过磁球释放后才能进一步分析，这使CTCs的检测和分析过程变得比较繁琐。MiltenyiBioec公司开发的MACS系统以及Veridex公司开发的CellSearch系统采用了纳米级的免疫磁珠捕获CTCs。其中，MACS系统使用的是粒径为50nm的纳米免疫磁珠，但是磁响应较慢，必须使用较强的磁场搭配专用的一次性磁分离柱才能完成CTCs的捕获，成本昂贵。CellSearch系统使用的是粒径为120-200nm的纳米免疫磁珠，其在捕获CTCs过程中增加了多步额外的步骤来增强纳米球的磁性，并且采用了捕获增强试剂来增强纳米免疫磁珠与抗原的结合，操作比较繁琐，且CellSearch系统的免疫磁珠已自2016年初就已经开始停止销售。国内武汉大学申请的201310614556.5专利，其专利名称为《一种循环肿瘤细胞的富集方法》，公开了一种CTCs的富集方法及其试剂盒，其中公开的免疫磁珠是以苯乙烯-丙烯酰胺共聚纳米球为模板，通过酰肼化、丁二酸酐化以及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)活化法得到PEI纳米球，再利用层层组装法在其表面层层组装油溶性的磁性纳米粒子nano-γ-Fe2O3，组装五层后，再在其表面包被SiO2，制备得到粒径为380nm的磁性纳米球，之后经过丁二酸酐化在纳米球表面引入羧基，再通过(EDC/NHS)活化磁球表面的羧基，然后把EpCAM抗体偶联到磁性纳米球上，制备得到免疫磁珠。该免疫磁珠捕获效率高、富集时间短以及特异性好，所捕获的细胞的活性率保持在(90.5±1.2)％。但是制备380nm磁性纳米球和免疫磁珠的步骤繁琐，制备过程复杂，成本高难以扩大规模。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是针对现有技术存在的不足提供一种EpCAM抗体免疫磁珠及其制备方法，本专利技术的EpCAM抗体免疫磁珠粒径小，磁响应性好，用于循环肿瘤细胞捕获，捕获效率高，富集时间短，捕获得到的肿瘤细胞可以进行进一步的分析，同时制备过程简单，成本低。在本专利技术的一方面，本专利技术是通过如下技术方案实现的：一种EpCAM抗体免疫磁珠，包括磁性微球部分和抗体部分，所述免疫磁珠的结构式为：A-NH-N＝CH-B，其中A表示磁性微球，B表示EpCAM抗体，或者A表示EpCAM抗体，B表示磁性微球。优选的，所述磁性微球为核壳结构的无机或有机高分子包裹的磁性微球。比如二氧化硅包裹的磁性四氧化三铁、或者葡聚糖包裹的磁性四氧化三铁等。最优选的，所述磁性微球部分为二氧化硅包裹的磁性四氧化三铁。优选的，所述EpCAM抗体免疫磁珠的粒径为200～300nm。在本专利技术的第二方面，提供了一种制备上述EpCAM抗体免疫磁珠的方法，其步骤包括：s1.磁性纳米簇的制备；s2.氨基修饰的磁性微球的制备；s3.肼基修饰的A部分的制备；s4.醛基修饰的B部分的制备；s5.免疫磁珠的制备：将步骤s3所述肼基修饰的A部分与步骤s4所述醛基修饰的B部分混合，在4～25℃下进行偶联反应2～24小时，得到所述免疫磁珠。在本专利技术的一种实施方式中，对氨基修饰的磁性微球进行醛基修饰，并且对EpCAM抗体进行肼基修饰。或者对氨基修饰的磁性微球进行肼基修饰，并且对EpCAM抗体进行醛基修饰，均可以实现上述结构的免疫磁珠。进一步的，所述步骤s3中的肼基修饰的A部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或EpCAM抗体用摩尔当量为10～50倍的SANH进行肼基修饰后得到的。最优选的，SANH的摩尔当量为氨基修饰的磁性微球或EpCAM抗体的25倍。所述SANH为对-丙腙基吡啶甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(CAS：362522-50-7)，在室温条件下可以温和的将氨基转换为肼基。所述SANH一般溶解在DMF溶液中进行反应，浓度可以根据磁性微球或EpCAM抗体的浓度进行调整，不影响反应结果。该反应过程可以在15～25℃室温条件下进行，反应时间根据本领域技术人员常规的检测技术判断，本专利技术一般采用对磁性微球的修饰反应时间16～24h，对EpCAM抗体的修饰反应时间2～4h。进一步的，所述步骤s4中的醛基修饰的B部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或EpCAM抗体用摩尔当量为5～20倍的SFB进行醛基修饰后得到的。最优选的，SFB的摩尔当量为氨基修饰的磁性微球或EpCAM抗体的10倍。所述SFB为4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(CAS：60444-78-2)，在室温条件下可以温和的将氨基转换为醛基。所述SFB一般溶解在DMF溶液中进行反应，浓度可以根据磁性微球或EpCAM抗体的浓度进行调整，不影响反应结果。该反应过程可以在15～25℃室温条件下进行，反应时间根据本领域技术人员常规的检测技术判断，本专利技术一般采用对磁性微球的修饰反应时间16～24h，对EpCAM抗体的修饰反应时间2～4h。所述步骤s1中的磁性纳米簇是通过水热法、溶剂热法或共沉淀法制备得到，也可以采用市售商品。制备磁性纳米簇的方法为本领域技术人员所熟知的技术，得到的产品只需要满足具有良好的磁性，并且可以与无机或有机高分子形成核壳结构即可。作为优选的，所述步骤s1中的磁性纳米簇是通过如下方法制备得到：1)在空气中，向二价铁盐的水溶液中加入氨水，然后搅拌使溶液变成黑色，得到黑色Fe3O4颗粒；2)向步骤1)中加入油酸，混合均匀后转移至本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种EpCAM抗体免疫磁珠，包括磁性微球部分和抗体部分，其特征在于：所述免疫磁珠的结构式为：A‑NH‑N＝CH‑B，其中A表示磁性微球，B表示EpCAM抗体，或者A表示EpCAM抗体，B表示磁性微球。

【技术特征摘要】
1.一种EpCAM抗体免疫磁珠，包括磁性微球部分和抗体部分，其特征在于：所述免疫磁珠的结构式为：A-NH-N＝CH-B，其中A表示磁性微球，B表示EpCAM抗体，或者A表示EpCAM抗体，B表示磁性微球。2.根据权利要求1所述的EpCAM抗体免疫磁珠，其特征在于：所述磁性微球为核壳结构的无机或有机高分子包裹的磁性微球。3.根据权利要求1所述的EpCAM抗体免疫磁珠，其特征在于：所述EpCAM抗体免疫磁珠的粒径为200～300nm。4.一种制备权利要求1-3中任一项所述EpCAM抗体免疫磁珠的方法，其步骤包括：s1.磁性纳米簇的制备；s2.氨基修饰的磁性微球的制备；s3.肼基修饰的A部分的制备；s4.醛基修饰的B部分的制备；s5.免疫磁珠的制备：将步骤s3所述肼基修饰的A部分与步骤s4所述醛基修饰的B部分混合，在4～25℃下进行偶联反应2～24小时，得到所述免疫磁珠。5.根据权利要求4所述EpCAM抗体免疫磁珠的制备方法，其特征在于：所述步骤s3中的肼基修饰的A部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或EpCAM抗体用摩尔当量为10～50倍的SANH进行肼基修饰后得到的。6.根据权利要求4所述EpCAM抗体免疫磁珠的制备方法，其特征在于：所述步骤s4中的醛基修饰的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈昌岳，蔡红东，刘关，马超，张祥林，
申请(专利权)人：上海美吉生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31