细胞冻存液及冻存方法技术

本发明专利技术涉及细胞领域，特别涉及细胞冻存液及冻存方法。该细胞冻存液包括DMSO、人血白蛋白和无血清培养基。该冻存液不含有动物源血清，避免了引入污染和过敏原的风险，与常规细胞冻存液相比具有更高的临床安全性。同时，本发明专利技术的GMSCs冻存液又能很好保持冻存细胞活性。

Cell freezing liquid and freezing method

The invention relates to the cell field, in particular to a cell freezing liquid and a freezing method. The cells were cryopreserved by DMSO, Human Albumin and serum-free medium. The frozen solution does not contain animal serum, avoids the risk of introducing contamination and allergen, and has higher clinical safety compared with the conventional cell freezing liquid. At the same time, the GMSCs frozen liquid can keep the activity of cryopreserved cells.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞领域，特别涉及细胞冻存液及冻存方法。
技术介绍
牙周病造成了牙齿周围支持组织的不可逆性损坏，而目前广泛用于牙周再生的治疗方法都没能完全实现牙周组织的生理性和功能性再生。牙周组织工程技术的发展为牙周缺损组织的修复和再生提供了新的思路和空间。牙周膜干细胞自被发现以来，其良好的干细胞性就已经得到了广泛认可，但其来源有限，需拔牙才能获取牙周膜组织，使其临床应用的潜能受到限制。而在组织工程学研究中，寻求来源广泛、取材方便的种子细胞一直是研究的重点和核心。同是牙周组织来源的牙龈组织，则具有取材方便、组织愈合能力强并且能够无疤愈合的特点。因此，来源于牙龈组织的牙龈间充质干细胞近几年受到了高度关注。间充质干细胞是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，在1966年首先由Friedenstein等从骨髓中发现的。大量研究发现，间充质干细胞不仅可以分化为多种间质组织的细胞，如骨、脂肪、软骨、肌肉、肌腱和韧带等。同时在一定的诱导条件下还可以横向分化为外胚层和内胚层细胞。如上皮细胞、神经元细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞、表皮干细胞等。目前研究表明，间充质干细胞来源十分广泛，除骨髓外，脂肪、脐带华通胶、胎盘、羊膜、肌肉、韧带、等均已分离培养出。近年来大量研究证明人体和动物的颅颌面部，特别是牙源性组织中存在具有特殊分化和再生功能的间充质干细胞。近年来因其在组织工程和细胞替代治疗的临床前研究而备受关注。牙龈间充质干细胞(gingiva－derivedmesenchymalstemcells，GMSCs)是组成牙龈结缔组织的主要间充质细胞。它是来源于中胚层的纤维母细胞，不仅具有活跃的自我更新的能力，并且还具有合成和降解胶原等细胞外基质的功能：I型和Ⅲ型胶原、纤维粘连蛋白等。因此GF在许多生理和病理过程中都起着十分重要的作用，可以维持胶原动态平衡，调节细胞相互作用，保护和修复牙龈组织，维持牙龈组织自身稳定性。近几年，干细胞库建立的需要以及临床上对干细胞的需求增加，对干细胞冻存与复苏方面的研究引起了越来越多的关注。与其他来源MSCs一样，GMSCs作为组织工程学研究和潜在临床应用的种子细胞，其过度传代会表现明显衰老或凋亡，且长期体外培养易发生自发分化，失去多分化潜能，增殖、黏附能力下降，细胞凋亡率增加，所以冻存GMSCs也是其研究应用的重要环节之一。细胞冻存液是一种细胞冻存时使用的溶液，它可以供给细胞生命代谢所必须的营养物质，同时可以防止或减少冷冻冰晶对细胞的损伤作用。目前常用的细胞冻存液或市售的细胞冻存液中通常是由二甲基亚砜(dimathylsulfoxide,DMSO)和胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)混合组成。DMSO是一种分子量小，且具有强溶解能力和渗透能力的化学物质。在许多研究中，DMSO是最常用的细胞冻存保护剂，用其保存的细胞复苏后与新鲜细胞比较，具有相似的表型、细胞表面标记及生长速率。DMSO的作用机制是在降温过程中透过细胞膜进入细胞内，降低细胞内、外未结冰溶液中电解质浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质损伤，同时细胞内水分不会过度外渗，避免细胞过度脱水皱缩。然而，DMSO对细胞有一定毒性作用，浓度过高会引起较高的渗透压，不利于细胞复苏。因此，目前DMSO常规使用浓度为1％～5％。FBS属于异源性物质，成分复杂，并存在引入污染和过敏原的风险，不适合于临床应用。特别是在细胞治疗中，异源性蛋白的存在，可能会引起不必要的，甚至是未知的不良反应，严重影响治疗结果。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供细胞冻存液及冻存方法。本专利技术公开了一种临床安全性高，同时又能很好保持冻存细胞活性的细胞冻存液，用于冻存GMSCs。本冻存液由DMSO、人血白蛋白和无血清培养基组成。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种细胞冻存液，包括DMSO、人血白蛋白和无血清培养基。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述的细胞冻存液以质量份计，包括如下组分：DMSO1份无血清培养基2～7份人血白蛋白0.4～1.4份。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述的细胞冻存液以质量份计，包括如下组分：DMSO1份无血清培养基2～7份质量浓度为20％的人血白蛋白注射液2～7份。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述的细胞冻存液以质量份计，包括如下组分：DMSO1份无血清培养基3～6份质量浓度为20％的人血白蛋白注射液3～6份。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述的细胞冻存液以质量份计，包括如下组分：DMSO1份无血清培养基4～5份质量浓度为20％的人血白蛋白注射液4～5份。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述的细胞冻存液以质量份计，包括如下组分：DMSO1份无血清培养基3份质量浓度为20％的人血白蛋白注射液6份。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述的细胞冻存液以质量份计，包括如下组分：DMSO1份无血清培养基4份质量浓度为20％的人血白蛋白注射液5份。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述的细胞冻存液以质量份计，包括如下组分：DMSO1份无血清培养基5份质量浓度为20％的人血白蛋白注射液4份。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述的细胞冻存液以质量份计，包括如下组分：DMSO1份无血清培养基6份质量浓度为20％的人血白蛋白注射液3份。本专利技术还提供了所述细胞冻存液在冻存间充质干细胞中的应用。本专利技术还提供了所述细胞冻存液在冻存牙龈间充质干细胞中的应用。本专利技术还提供了一种细胞冻存方法，取细胞与本专利技术提供的细胞冻存液混合，冻存。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述细胞冻存方法中所述细胞为牙龈间充质干细胞。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述细胞冻存方法中所述冻存液的添加量为：每1.5×106个细胞添加所述冻存液1mL。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述细胞冻存方法中所述冻存为于4℃预冷，再置于-80℃超低温冰箱2～3天后，液氮保存。本专利技术公开一种GMSCs冻存液，由DMSO、人血白蛋白和无血清培养基组成。该冻存液不含有动物源血清，避免了引入污染和过敏原的风险，与常规细胞冻存液相比具有更高的临床安全性。同时，本专利技术的GMSCs冻存液又能很好保持冻存细胞活性。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示GMSCs表面marker流式结果图；图2示GMSCs细胞形态图；其中，图2(A)示40×，图2(B)示100×；图3示各组复苏后细胞活率比较；图4示GMSCs生长曲线；其中，图4(A)示对比例GMSCs生长曲线，图4(B)示实施例3GMSCs生长曲线；图5示GMSCs形态图；图6示冻存前GMSCs表面marker流式结果图；图7示实施例3GMSCs复苏培养表面marker流式结果图；图8示对比例GMSCs复苏培养表面marker流式结果。具体实施方式本专利技术公开了一种细胞冻存液及冻存方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞冻存液，其特征在于，包括DMSO、人血白蛋白和无血清培养基。

【技术特征摘要】
1.一种细胞冻存液，其特征在于，包括DMSO、人血白蛋白和无血清培养基。2.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，以质量份计，包括如下组分：DMSO1份无血清培养基2～7份人血白蛋白0.4～1.4份。3.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，以质量份计，包括如下组分：DMSO1份无血清培养基2～7份质量浓度为20％的人血白蛋白注射液2～7份。4.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，以质量份计，包括如下组分：DMSO1份无血清培养基3～6份质量浓度为20％的人血白蛋白注射液3～6份。5.根据权利要求1至4任...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海佳，王一飞，葛啸虎，戚康艺，王小燕，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44