本发明专利技术公开一种用于Mg2+检测的细胞膜靶向荧光探针及其制备方法和应用。该探针上的羧基及与其相邻的羰基对Mg2+具有络合能力，羧基与酚羟基在中性至弱碱性条件下解离，形成水溶性基团，靶向标记在细胞膜外表面，不能穿过细胞膜进入细胞内；另外，探针本身具有较弱的荧光，在生理条件下可选择性的与Mg2+结合，生成具有较强荧光的衍生产物，当探针所在区域Mg2+减少时，与其结合的Mg2+解离，可以动态监测细胞内Mg2+向胞外排放的过程。本发明专利技术提供的细胞膜靶向Mg2+荧光探针的制备方法仅需两步，简单易行。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种能够通过荧光成像来动态监测细胞中Mg2+胞外释放的细胞膜靶向荧光探针及其制备方法和应用，属于生物检测
技术介绍
Mg2+是细胞内存在最广泛的二价金属离子，在细胞的扩散和凋亡、DNA的合成控制、蛋白质的磷酸化以及能量的传递等许多生理过程中都起着决定性的作用，因此，细胞乃至组织中Mg2+的浓度和分布是生物、医学等领域中相关科学研究的基础问题。Mg2+生理作用又与其浓度密切相关，然而Mg2+是简单离子，仅由一个原子构成，价态稳定，难以生成和消灭，仅能通过进出细胞膜维持和改变胞内浓度。Mg2+从胞外进入胞内，可以用Mg2+同位素进行直接观察，而Mg2+从胞内释放到胞外，却缺乏直接有效的观察方法。目前，仅能通过酯溶性荧光探针检测细胞内Mg2+的浓度，间接获得Mg2+从胞内释放到胞外的状况。然而，由于细胞内Mg2+的浓度变化是Mg2+摄入/排出细胞两个过程的综合结果，摄入异常和排出异常均能引起胞内Mg2+变化，难以判断细胞内Mg2+浓度变化的确切原因。因此，有必要设计合成一种细胞膜靶向Mg2+荧光探针，用于直接准确地监测细胞Mg2+外排状态。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能够靶向标记在细胞膜外表面的细胞膜靶向Mg2+荧光探针，并提供该探针的合成方法。所提供的探针能用于直接准确监测细胞膜外表面处Mg2+浓度变化。本专利技术所提供的技术方案具体如下：一种细胞膜靶向型Mg2+荧光探针，其化学名称为1-羧基-5-甲酰十六胺荧光素，具有式(I)所示的结构：该结构中，羧基及与其相邻的羰基，对Mg2+具有络合能力，羧基与酚羟基在中性至弱碱性条件下解离，形成水溶性基团，使其固定于细胞膜外表面，不能穿过细胞膜进入细胞内。长链的十六烷基疏水端可插入细胞膜，使探针仅对细胞膜进行靶向性标记，共同实现细胞膜外表面区域Mg2+的检测。控制细胞外培养基或生理缓冲溶液不含Mg2+，则细胞膜外表面区域的Mg2+浓度将只由细胞内排出的Mg2+决定，从而实现细胞内Mg2+外排的直接观察。一种制备上述细胞膜靶向型Mg2+荧光探针的方法，包括以下步骤：(1)室温下，将氯化偏苯三酸酐和十六胺分别溶于有机溶剂，得到氯化偏苯三酸酐溶液和十六胺溶液；将十六胺溶液滴加到氯化偏苯三酸酐中，混合均匀后在室温下搅拌反应，减压除去有机溶剂，得到偏苯三酸酐酰十六胺粗品；(2)将偏苯三酸酐酰十六胺粗品和2,4-二羟基苯甲酸加入甲基磺酸中，40-90℃保温1-24小时，待冷却至室温后向反应液中滴加碱液至甲基磺酸完全被中和，随后酸化，过滤，所得固体用柱层析分离提纯，即得到式(I)所示的细胞膜靶向型Mg2+荧光探针。优选地：氯化偏苯三酸酐和十六胺的摩尔用量比为1:1。步骤(1)所述的有机溶剂为二氯甲烷。偏苯三酸酐酰十六胺和2,4-二羟基苯甲酸的摩尔用量比为1:1；偏苯三酸酐酰十六胺和甲基磺酸的用量比为1mmol/20mL。步骤(2)所述的碱液为5mol/L的NaOH溶液。步骤(2)酸化采用的溶液为1mol/L的盐酸溶液。上述细胞膜靶向型Mg2+荧光探针在Mg2+检测领域中的应用。本专利技术提供的Mg2+荧光探针，其荧光性质是基于光诱导电子转移(PET)机理而设计，探针本身具有较弱的荧光，在生理条件下与Mg2+结合形成络合物，荧光强度有明显增加。该探针虽然对Mg2+与Ca2+均有响应，但对Mg2+的灵敏度高于Ca2+一个数量级以上，可视为Mg2+的选择性探针，生物体和环境中常见其它物质以及生物介质并不构成干扰。该探针包含的饱和长链烷基可嵌入到细胞膜中实现非共价标记，同时水溶性的酚羟基和羧基保证探针只标记在细胞膜的外表面而不会进入到细胞内部，适合于检测通过细胞膜释放到细胞膜外表面区域的Mg2+。本专利技术具有以下优点和有益效果如下：1.与已有Mg2+荧光探针相比，本专利技术提供的细胞膜靶向Mg2+荧光探针能够标记在细胞膜外表面。2.本专利技术提供的细胞膜靶向Mg2+荧光探针可实现对通过细胞膜释放到胞外的Mg2+的实时原位检测。3.本专利技术提供的细胞膜靶向Mg2+荧光探针与Mg2+结合反应前后荧光强度有明显增强，且对Mg2+的响应动态可逆。4.本专利技术提供的细胞膜靶向Mg2+荧光探针的制备方法仅需两步，简单易行。附图说明图1为1-羧基-5-甲酰十六胺荧光素的合成路线图。图2为1-羧基-5-甲酰十六胺荧光素及其Mg2+结合物的荧光光谱图；其中，1是1-羧基-5-甲酰十六胺荧光素与Mg2+结合物的激发光谱，1’是1-羧基-5-甲酰十六胺荧光素与Mg2+结合物的发射光谱；2是1-羧基-5-甲酰十六胺荧光素本身的激发光谱，2’是1-羧基-5-甲酰十六胺荧光素本身的发射光谱。图3为1-羧基-5-甲酰十六胺荧光素用于检测HeLacells细胞膜外表面区域Mg2+的荧光成像图；其中，图3(A)为1-羧基-5-甲酰十六胺荧光素与细胞孵育1分钟后荧光成像图，图3(B)为图3(A)的明场；图3(C)为1-羧基-5-甲酰十六胺荧光素与细胞孵育1分钟后再加入1mMMg2+后荧光成像图，图3(D)为图3(C)的明场。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步描述，仅在于说明本专利技术而绝不限制本专利技术。实施例1将2.10g氯化偏苯三酸酐(0.1mol)溶于50mL二氯甲烷，室温下滴加2.4g十六胺(0.1mol)的50mL二氯甲烷溶液，混合物室温下搅拌反应1小时，减压除去溶剂，得偏苯三酸酐酰十六胺粗品4.1g，无需纯化，直接用于下一步反应。在20mL甲基磺酸中加入416mg偏苯三酸酐酰十六胺(1mmol)和154mg2,4-二羟基苯甲酸(1mmol)，85℃保温3小时。冷却至室温，用5mol/LNaOH溶液中和甲基磺酸，随后再用1mol/L盐酸酸化，有大量桔黄色沉淀生成。过滤收集固体，柱层析分离提纯，得1-羧基-5-甲酰十六胺荧光素65mg。1HNMR：0.87-0.90(t,3H),1.28(s,28H),3.40-3.46(m,2H),6.51–6.60(m,4H),6.67(s,2H),7.30(d,1H),7.60(s,1H),8.11(d,1H),8.19(d,1H),8.41(s,1H)。质谱ESI-MS：598.2(M-H),600.2(M+H)。实施例2将2.10g氯化偏苯三酸酐(0.1mol)溶于50mL二氯甲烷，室温下滴加2.4g十六胺(0.1mol)的50mL二氯甲烷溶液，混合物室温下搅拌反应3小时，减压除去溶剂，得偏苯三酸酐酰十六胺粗品，无需纯化，直接用于下一步反应。在20mL甲基磺酸中加入偏苯三酸酐酰十六胺(1mmol)和154mg2,4-二羟基苯甲酸(1mmol)，40℃保温24小时。冷却至室温，用5mol/LNaOH溶液中和甲基磺酸，随后再用1mol/L盐酸酸化，有大量桔黄色沉淀生成。过滤收集固体，柱层析分离提纯，得1-羧基-5-甲酰十六胺荧光素。实施例3将2.10g氯化偏苯三酸酐(0.1mol)溶于50mL二氯甲烷，室温下滴加2.4g十六胺(0.1mol)的50mL二氯甲烷溶液，混合物室温下搅拌反应5小时，减压除去溶剂，得偏苯三酸酐酰十六胺粗品，无需纯化，直接用于下一步反应。在20mL甲基磺酸中加入偏苯三酸酐酰十六胺(1mmol)和1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种细胞膜靶向型Mg2+荧光探针，其特征在于，具有式(I)所示的结构：
【技术特征摘要】
1.一种细胞膜靶向型Mg2+荧光探针，其特征在于，具有式(I)所示的结构：2.一种制备权利要求1所述的细胞膜靶向型Mg2+荧光探针的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)室温下，将氯化偏苯三酸酐和十六胺分别溶于有机溶剂，得到氯化偏苯三酸酐溶液和十六胺溶液；将十六胺溶液滴加到氯化偏苯三酸酐中，混合均匀后在室温下搅拌反应，减压除去有机溶剂，得到偏苯三酸酐酰十六胺粗品；(2)将偏苯三酸酐酰十六胺粗品和2,4-二羟基苯甲酸加入甲基磺酸中，40-90℃保温1-24小时，待冷却至室温后向反应液中滴加碱液至甲基磺酸完全被中和，随后酸化，过滤，所得固体用柱层析分离提纯，即得到权利要求1所述的细胞膜靶向型Mg2+...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭小峰，王红，
申请(专利权)人：武汉大学苏州研究院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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